层析分离方法.doc
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1、层析分离方法概 述 层析法是一种使不同分子相互分离的过程,当一混合样品被导入一固定相的支持体中,而另一流体(移动相)通过时,由于样品各组分与固定相和移动相相互作用的大小不同,使各组分通过固定相支持体的速率不同而得分离。层析法的特点:能分离一系列结构较为相似的成分,以达到一般分离方法难以达到的目的。 层析常见种类及用途:a.柱层析分离量较大,主要用于分离制备;b.薄层层析主要用于分析鉴定,也可用于半微量制备。c.纸层析主要用于分析鉴定,也可用于半微量制备。 层析法按分离原理大体上又可以分为(1) 吸附层析(利用吸附能力的差别进行分离),常用的吸附剂有氧化铝、硅胶、聚酰胺等;(2) 分配层析(利用
2、在二种不互溶的溶剂中分配比不同进行分离),常用的支持剂为硅胶、硅藻土、纤维粉等,反相硅胶(键合硅胶)、液滴逆流层析则是分配层析与逆流分溶的发展;(3) 离子交换层析(利用离子解离强度不同进行分离),常用的离子交换树脂有强酸性(磺酸型)、强碱性(季胺型)、弱酸性(羧酸型)、弱碱性(三级胺型);(4) 电泳(利用电流通过时,离子趋电性不同进行分离),常用的有纸电泳、琼脂电泳、凝胶电泳。(5) 其他有气体层析、凝胶层析、亲和层析等, 层析方法的选择:(1) 非极性的成分常选择氧化铝或硅胶吸附层析;(2) 极性较大则采用分配层析或弱吸附剂吸附层析;(3) 酸性、两性成分可用离子交换层析,有时也可用吸附
3、层析及分配层析。 各类化合物适宜的层析方法:a. 一般生物碱的分离可用硅胶或氧化铝层析,对极性较高的生物碱也可用分配层析,而对季胺型水溶性生物碱也可用分配层析或离子交换层析。b. 甙类的层析分离往往决定于甙元的性质,如皂甙、强心甙,一般可用分配层析或硅胶吸附层析。 c. 芳香油、甾体、萜类(结合成甙除外)包括萜类内酯,往往首选氧化铝及硅胶层析,若在氧化铝柱上有次级反应,则宜用硅胶吸附层析。 d. 黄酮体、单宁等多元酚衍生物可用聚酰胺吸附层析。 e. 有机酸、氨基酸一般可选用离子交换层析,有时也用分配层析,有些氨基酸也可用活性炭吸附层析。f. 多肽、多糖等大分子化合物,常用凝胶层析、亲和层析、反
4、相硅胶(键合硅胶)。第一部分 柱层析第一章 硅胶层析一、 层析用硅胶层析用硅胶一般以SiO2xH2O表示,系多孔性的硅氧环Siloxane(a)交链结构,由于其骨架 表面具有很多硅醇Silanol(b)基团,能吸着多量水分,此种水分几乎成游离状态存在,因此当加热至100左右能可逆地被除去。硅胶的活性水分含量有关(见表7-1),表7-1 氧化铝和硅胶含水量与活性的比较硅胶加入水量(%)活性氧化铝加入水量(%)0I05II315III625IV1038IV15含水量高则吸附力减弱,当游离水含量高达17%以上,吸附能力降低,而可作为分配层析载体。硅胶于500加热能不可逆地失去结合水(一般170以上即
5、有少量结合水失去),从硅醇结构变成硅氧环结构,若加热至1,100则结合水尽失。由于硅胶的吸附能力主要与硅羟基数量有关,因此加热温度过高吸附能力反而降低。 有时硅胶层析具有吸附层析与分配层析的双重性质,甚至还有极弱的离子交换作用。 层析硅胶应是中性无色颗粒,但是由于制作过程常可带有酸性,如果酸性不强于pH5,一般已可使用。 商品层析硅胶合格的判定a. PH值一般先检查其是否中性。取硅胶一份混悬于100份水中放置,应得澄清的中性溶液。如滤液为酸性,应水洗至中性,再行活化处理。b. 铁离子的检查一般将硅胶混悬于盐酸中,搅拌,如含铁离子则与盐酸结合成复合物而显黄色。有铁离子存在即预示有其他金属盐存在的
6、可能性,因此最好以盐酸洗涤处理。在特殊情况下,硅胶须经乙醚、氯仿等有机溶剂预洗,至洗出液蒸干无残渣为止。 由于硅胶容易吸水,因此用前最好经120烘24小时活化,可不作活性测定。 硅胶的改良:向层析硅胶中加入一种复合试剂,以改良吸附性能,提高分离效果,称改良吸附剂。例如以硝酸银处理的硅胶对不饱和烃类有极好的分离作用。以110%复合试剂的水或丙酮溶液,与硅胶混匀,待稍干后于110干燥即可。表7-2 常用改良吸附剂复合试剂选择性分离物0.10.5 N 酸或碱pH敏感物质(生物碱、酸性、酚性、两性物质)AgNO3具有双键或三键物质硼酸、硼酸钠、碱式醋酸铅多羟基化合物亚硫酸钠醛类氯化铁羟基喹啉类硫酸铜胺
7、类铁氰化锌磺胺类二、硅胶吸附层析的应用 硅胶层析的优、缺点:优点:(1) 有些化合物用氧化铝层析,吸附剂副反应较多,而且某些副反应即使用中性氧化铝仍难以避免。而硅胶作吸附剂虽也有个别发生异构化,但一般副反应较少;(2) 某些酸性、酚性物质、色素等易与氧化铝结合而不宜使用氧化铝层析,硅胶则无此特性;(3) 氧化铝层析样品损失较多,而硅胶层析样品回收率较高。缺点:(1) 即分离效果有时较氧化铝为差,对杂质的吸附能力差;(2) 样品处理量相应的比氧化铝为低。 硅胶吸附层析的操作快速层析(Flash Chromatography)既快速简便,又有相当分离效果。注;玻璃磨口连接处用弹簧或橡皮圈扣紧。橡皮
8、管连接处一般在压力为1kg/cm2以下不会脱开。 操作步骤1 装柱A.干法向层析柱中加入0.51cmn高的硅胶H(100200 mesh/目),再将硅胶H(300400 mesh左右,即38mm(1040mm))装入柱,敲紧或在出口处抽真空吸紧,使硅胶层高约1820cm,硅胶层面应水平,上部再加0.51cm高的纯净砂层或滤纸。然后加入洗脱用的溶剂,加压赶去硅胶内气泡,溶剂压至硅胶层顶面,此时硅胶层高约1517cm。B. 湿法b1.即将硅胶混悬于装柱溶剂中,不断搅拌待空气泡除去后,连同溶剂一起倾入层析柱中。最好一次倾入,否则由于不同粒度大小的硅胶沉降速度不一,使硅胶柱有明显的分段,容易影响分离效
9、果。b2.向硅胶中加入一定体积的溶剂,充分搅匀,加入到预先装有一定体积溶剂的层析柱内(已加粗硅胶H),同时打开活塞放出溶剂,硅胶下降。加压赶去硅胶内气泡,至层高约1820cm,溶剂压至硅胶层顶面,此时硅胶层高约1517cm。2. 硅胶柱内包含溶剂体积的确定(干法)取一定体积V0的溶剂,加压至砂板处,将层析柱的活塞稍打开,使溶剂滴入接受器中,当氧化铝柱上面的溶剂液面刚好降至填料表面,关闭活塞,量取接受器内溶剂量V1。则V0 - V1即氧化铝柱内包含溶剂的体积DV。依据DV,在层析过程中,可知在什么时候开始收集流份。当变换溶剂的时候,就可知道新换溶剂大致在何流份开始。3. 加样 用尽量少的溶剂溶解
10、样品,然后加至柱中,加压压入硅胶层。难溶样品拌入少量硅胶再装入,上面再复以砂层。 4. 洗脱根据薄层层析资料的判断,用在硅胶薄层板上欲分点为Rf=0.20.3的展开溶剂洗脱,如有多点需分离时,可以改变洗脱溶剂的比例。用减压阀控制压力以调节洗脱速度,收集馏分。而且为了尽量减少被分离化合物在层析柱中扩散,层析过程中不能有间歇。5. 样品收集 每一馏分用薄层板点样分析,每块薄层板上可点数个馏分点,用原料做对照,前一块板的最后一点应用于下一块板的第一点做对照点。将相同位置点的馏分合并,蒸除溶剂。 柱的粗细和进样量等的关系(表1) 这时施加的压力约0.40.7kg/cm2(可用压力表指示)。为了达到最好
11、分离效果,使用者可根据具体样品摸索条件。表1柱内径(mm)硅胶用量(g)加样量(g)流速(ml/min)每一馏分体积(ml)14 17 25 35 5210 16 35 70 1500.2 0.5 12 4 85 10 15 20 302.5 4 8 15 25例:1.2g原料反应5d后,用硅胶薄层层析显示(展开剂:石油醚/乙酸乙酯8:2),主要为二个斑点:Rf分别为0.23和0.14,相应于未反应原料和产物。 用快速层析法分离(柱内径25mm,青岛海洋化工厂硅胶H 35g,硅胶层加压后高17cm)。先用120ml石油醚/乙酸乙酯(8:2)洗脱,再用400ml石油醚/乙酸乙酯(8:2)洗脱。加
12、压力0.7 kg/cm2,流速0.5ml/min。开始80ml未收集,以后收集15ml左右为一馏分。馏分17:0.01g,低极性物;馏分815:0.49g,相应于Rf 0.23的原料;馏分1618:交叉馏分;馏分1934:0.37g相应于Rf 0.14的产物。收集时间约1.5h。 总之,此层析法可用于Rf差0.05到0.1的组分分离,一般在2h左右可分离一个样品,既达到一般柱层析的分离效果,又节省了时间,而且溶剂和硅胶用量也可减少。对不太稳定的化合物,用此法分离尤为适用。吸附柱层析硅胶的用量样品与吸附剂的比例可为1:3060,但必须根据分离工作的难度,较难分离者有时甚至可选用1:5001000
13、。硅胶吸附层析适用范围使用比较广泛,能用于非极性化合物,也能用于极性化合物,适用于芳香油、萜类、甾体、生物碱、强心甙、蒽醌类、酸性、酚性化合物、磷脂类、脂肪酸、氨基酸,以及一系列合成产品如有机金属化合物等。三、硅胶的再生1. 由于硅胶对杂质及色素吸附力差,因此回收操作比氧化铝简单,一般可用乙醇或甲醇洗涤,或于索氏提取器连续抽提除去杂质,洗净的硅胶待溶剂挥发除去后,烘干活化处理即可使用。2. 硅胶的再生也可用510倍体积的1氢氧化钠煮沸半小时,如仍不成强碱性(以酚酞作指示剂),可追加适量1氢氧化钠,趁热过滤,以蒸馏水洗三次,冉以36倍5盐酸煮沸半小时,以蒸馏水洗至中性,120活化,过筛即得。四、
14、分配层析的原理及操作一种溶质在两种不相互溶的溶剂中振摇,当达到平衡时,溶质在两层中浓度都有恒定的比例,这一比值称作该物质在这两种溶剂中的分配系数。如果需要分离的两种物质,在两相中的分配系数比较接近,则须利用不断地进行反复分配,如使用逆流分溶及分配层析才能达到目的。1分配层析的原理分配层析是以一种多孔物质吸着一种极性溶剂,此极性溶剂在层析过程中始终固定在支持剂上,因此称为固定相。另用一非极性溶剂(与固定相不相互溶)洗脱,此洗脱剂在层析过程中始终是移动的,称为移动相。溶质在固定相和移动相之间,在柱上作连续的、动态的不断分配,由于不同成分在两相间分配系数的差异而得以分开。2. 影响分离效果片的因素两
15、者的分配系数差值。如果相差较大,只要用较小的柱和较少的硅胶用量即能满意地分离,如果分配系数差值极小,则同样重量的样品往往要用较大的柱和用较多的硅胶才能分开。3. 分配层析所用多孔支持剂主要有硅胶、硅藻土(商品名Celite)、纤维粉等,近年来并有用有机支持剂的,如微孔聚乙烯粉等。 操作分配层析所用的仪器操作一般与吸附层析相同,将预先选定的固定相溶剂(一般为水溶液或极性溶剂)加入支持剂硅胶中,搅拌混合均匀,倾入事先选定的移动相溶剂中,激烈搅拌,使两相互相饱和达到平衡。层析管中放移动相(事先务必用固定相溶剂剧烈振摇,互相饱和,以造成层析时稳定的平衡条件),将上述吸着固定相的硅胶湿法装柱,不断轻敲管
16、壁或加压,使固定相支持剂压紧。样品一般可溶于移动相中上柱,继以移动相洗脱,按固定体积收集,分别浓缩处理。 分配层析操作注意事项:(1) 移动相体积常大于固定相5l0倍,即相当于以510倍体积的有机溶剂向水溶液萃取,而分配系数的含意为溶质在两相中的浓度比,若体积增大,实际抽提出量也大。因此在分配层析中选择固定相与移动相时,要考虑样品在两相中的分配比(样品于移动相中的浓度/样品于固定相中的浓度),应在0.10.2时较适宜。较大则很快从柱上洗脱,分离效果较差,如分配比过大则可采用反相分配层析,即以非极性溶剂作固定相,极性溶剂作移动相。(2) 所用固定相与移动相溶剂,务必相互饱和,否则层析过程中固定相
17、体积不断减少或增加,平衡条件就被扰乱。(3) 选用支持剂(硅胶)与吸着固定相的比例为1:0.51即层析时硅胶吸有相当于本身重量50100固定相溶剂,较为适宜。(4) 样品上柱可采取三种方式:a. 如样品能溶于移动相溶剂,可用少量移动相溶剂溶解,加于柱顶再行展开;b. 如样品难溶于移动相,易溶于固定相,则可用少量固定相溶剂溶解,用硅胶吸着,装于柱顶再行展开;c. 如果样品在两相中溶解度均不大,则可溶于适当的溶剂,拌于干燥硅胶上,待溶剂挥发去尽后,加50100的固定相溶剂拌匀再上柱。(5) 层析柱固定相支持剂段直径与长度的比为l:1020,对分配系数比较接近的成分分离,往往可加大至1:40以上。(
18、6) 分离样品时支持剂的用量一般较吸附层析为大,为1:1001,000,主要决定于分离工作的难易,对分配系数比较接近的成分的分离甚至可采用1:10010,000。(7) 为使溶质在两相间达到平衡,移动相流速宜慢些,大致固定相支持剂的直径与高度为2.650厘米,流速0.07毫升分钟;4.565厘米为0.3毫升/分钟;5.590厘米为0.6毫升分钟;6.5115厘米为1.2毫升分钟。(8)分配系数往往会因温度变化而变化。因此对要求较高的实验,层析管最好有隔层套管,以便通水保持恒定的温度。五、分配层析溶剂系统的选择一般酸性酚性物质及生物碱类常可用缓冲液(酸、碱性溶液)作为固定相(见表7-5)。还可根
19、据具体化合物的溶解度、极性情况灵活选用。表7-5 硅胶分配层析溶剂系统的选择化合物名称固定相移动相水溶性生物碱水或缓冲溶液丁醇缓冲溶液乙酸乙酯甙类水氯仿或乙酸乙酯水乙酸乙酯(含0.5%甲醇)酚性化合物水环己烷有机酸0.05N或0.5N H2SO4环己烷:氯仿(或石油醚、苯、乙醚)=3:1磷酸缓冲溶液氯仿:乙醚=1:1或环己烷氨基酸的DNP衍生物不同pH的缓冲溶液乙醚、氯仿、正丁醇甾体化合物水石油醚甲醇环己烷乙二醇甲苯甲酰胺异丙醚六、硅胶分配层析的应用分配层析分离主要决定于分配系数的差异,一般说各类型化合物均能适用,特别适用于水溶性、亲水性物质而又稍能溶于有机溶剂中者,因此刚巧能弥补一般吸附层析
20、(如氧化铝层析适用于亲脂性物质)的不足。但分配层析样品处理量较少。分配层析往往适用于水溶性及极性较大的生物碱、甙类(强心甙,皂甙)、有机酸、酚性成分、糖类及氨基酸的衍生物,对某些非极化合物如甾体、油酯等有时也可用反向分配层析进行分离。七、硅胶分配层析操作实例狄戈辛(Digoxin) 即异羟基洋地黄毒甙)的分离国产层析硅胶80100目用量为分离样品的100倍,加23量的水(预先以乙酸乙酯饱和)调匀,再以乙酸乙酯(水饱和)浸泡,调成稀糊状,湿法装柱,柱直径与长度比为1:20以上。取毛地黄次生甙总甙与12倍量硅胶磨匀,加入柱顶,用水饱和的乙酸乙酯(含0.5%甲醇)洗脱,分部收集,各流份均作纸层析及薄
21、层层析(硅胶G硬板)检查,比移值相同部分合并,减压蒸干,以甲醇结晶,得洋地黄毒甙(Digitoxin)、羟基洋地黄毒甙(Ci-toxin)、异羟基洋地黄毒甙(Digoxin)等三种单体。硅胶G薄层层析展开溶剂:二氯乙烷-甲醇-甲酰氨(80:19:1);显色剂:三氯醋酸。第二章 氧化铝层析 氧化铝层析适用于亲酯性成分分离。广泛用于生物碱、甾体化合物、强心甙、精油、内酯化合物等中草药成分的分离。 优缺点有价廉、分离效果好、再生容易等优点;缺点是能与部分酚性化合物(如有些黄酮类化合物、部分三萜酸)结合因而不能应用。 一、各种氧化铝的制备及其应用层析用氧化铝的种类及用途:1. 碱性氧化铝pH 910。
22、用于碳氢化合物的分离,和从碳氢化合物中除去含氧化合物,以及某些对碱溶液比较稳定的中性色素、甾族化合物、生物碱、醇,以及其他中性、碱性物质的分离。2中性氧化铝 pH7.5。应用最广泛,适用于醛、酮、醌、某些甙及酸碱溶液中不稳定的化合物如酯、内酯等化合物的分离。3酸性氧化铝pH 44.5。适用于天然及合成酸性色素及某些醛、酸的分离。 水提取液二、氧化铝的活化及活性的改变1氧化铝的活化 氧化铝的活性与含水量关系极大,在一定温度下除去水分就可以使氧化铝活化。氧化铝加入一定量水即可使活性改变。活性水量的关系大致如图6l。表6 1 氧化铝中加入水量与活性关系加入水量%氧化铝活性0I级3II级6III级10
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