基因操作原理与方法.ppt
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1、基因工程原理与方法,基因操作、基因重组、基因工程 基因克隆、分子克隆,First, restriction endonucleases cleave DNA at specific sequences to generate a set of smaller fragments. Second, the DNA fragment to be cloned can be isolated and joined to a suitable cloning vector using DNA ligase to seal the DNA molecules together.,基因操作常用技术,一、宿
2、主与质粒、感受态的制备 二、重组质粒的提取 三、基因工程载体 四、DNA的酶切 五、DNA片段的回收 六、 DNA片段与载体的连接 四、基因克隆策略 五、重组DNA的鉴定 六、基因组与RNA的提取 七、文库构建 八、核酸探针 九、DNA序列测定 十、基因定点突变 十一、基因表达,基因工程的基本过程,目的基因的获得 载体的酶切 目的基因与载体的连接 连接物转化大肠杆菌 转化子的筛选 重组质粒的鉴定,工具酶及其应用,分子生物学中常用的工具酶有限制性内切酶、DNA连接酶、Rnase A、碱性磷酸酶、DNA聚合酶、T4多聚核苷酸激、核酸酶,一限制性内切酶与连接酶,Restriction endonuc
3、leases & ligase 能识别并切割dS-DNA分子内特殊核甘酸序列的酶称为限制性核酸内切酶。,1952午Luria和Human在研究T偶数噬茵体及1953年Bertani和Weigle在研究和P2噬菌体的宿主范围时发现:当一个噬茵体从其天然宿主E. coli品系A转到另一个品系B细胞中时,往往不能生长。他们把此现象称为宿主控制性限制现象 1962年,Arber及其同事们作了大量工作,经过放射性同位素标记证明,噬菌体在新品系中的损害伴随有其DNA的降解,但宿主自己的DNA并不降解,他们提出了限制-修饰酶假说来解释这种现象。,细菌的限制与修饰系统,Restriction endonucl
4、eases are found in a wide range of bacterial species. Werner Arber discovered that their biological function is to recognize and cleave foreign DNA (e.g., the DNA of an infecting virus); such DNA is said to be restricted. The cells own DNA is not cleaved because the sequence recognized by the restri
5、ction endonuclease is methylated (and thereby protected) by a specific DNA methylase. The restriction endonuclease and the corresponding methylase in a bacterium are sometimes referred to as a restriction-modification system. There are three types of restriction endonucleases, designated I, II, and
6、III. Types I and III are generally large, multisubunit complexes containing both the endonuclease and methylase activities. Type I restriction endonucleases cleave DNA at random sites that can be 1,000 base pairs or more from the recognition sequence. Type III enzymes cleave the DNA about 25 base pa
7、irs from the recognition sequence. The type II restriction enzymes, first isolated by Hamilton Smith, are simpler, require no ATP, and cleave the DNA within the recognition sequence itself?The extraordinary utility of the type II enzymes was first demonstrated by Daniel Nathans, and these are the en
8、zymes used most widely for recombinant DNA work.,More than 800 restriction endonucleases have been discovered in different bacterial species. Over 100 different specific sequences are recognized by one or more of these enzymes. These sequences are almost always short (four to six base pairs, occasio
9、nally more) and palindromic,Some restriction endonucleases cleave both strands of DNA so as to leave no unpaired bases on either end; these ends are often called blunt ends . Others make staggered cuts on the two DNA strands, leaving two to four nucleotides of one strand unpaired at each resulting e
10、nd. These are referred to as cohesive ends or sticky ends. because they can base-pair with each other or with complementary sticky ends of other DNA fragments.,常用限制性内切酶(RE),(一)产生3凹端的RE BamH:G GATCC EcoR :G AATTC Hind : A AGCTT Sal : G TCGAC Xba : T CTAGA Xho : C TCGAG,BamH: G GATCC NNNGGATCCNNN NNNC
11、CTAGGNNN BamH NNNG GATCCNNN NNNCCTAG GNNN,(二)产生3凸端的RE Kpn : GGTACC Pst : CTGCAG NNNGGTACCNNN NNNCCATGGNNN Kpn NNNGGTAC CNNN NNNC CATGGNNN,三、产生平端的RE EcoR: GAT ATC Sma:CCC GGG NNNNGATATCNNNN NNNNCTATAGNNNN EcoR NNNNGAT ATCNNNN NNNNCTA TAGNNNN,限制酶活性单位的定义:在限定的温度和缓冲液下,1小时消化1gDNA所需要的酶量。 多数RE在37时活性最高,因此,酶切
12、地般在37 消化,但少数RE例外,如Sma则在30时活性最高,如何进行限制酶切反应 DNA的酶切反应一般总反应体积常用20l,DNA量用0.1-1.0 g。在一微量离心管中分别加入以下反应组份 1、10反应Buffer2 l 2、DNA. 0.1-1.0 g 3、限制酶2-5 4、水补至20l 将上述各组份混匀后,置适当温度(多为37 )作用1-4小时,进行琼脂糖凝胶电泳鉴定. 注意:由于目前RE价格大幅度下降,多数情况下均是超量用酶。如大部分RE的浓度在10-15 /l, 对于一般的酶切鉴定Promega公司推荐用0.5l,而TaKaRa公司推荐用1l,这均已大大超过实际所需用量,Summa
13、ry animation of the running of an agarose gel,DNA酶切注意事项 1. 市售RE酶均保存在含50%的甘油储藏Buffer中,甘油在酶切反应中浓度过高,对酶切效率有抑制作用,所加酶量不能超过反应总体积的1/10,特别注意控制在多个酶切反应中酶的总量。 2. 目前,在DNA的酶切反应中,往往超量使用酶。市售RE酶的浓度多数为10 / l。以前,RE特别昂贵,多取0.1 l RE进行小量DNA的酶切鉴定。目前,价格已大大降低,可不必如此经济。如TaKaRa公司酶的说明书要求小量DNA的酶切鉴定用1 l 每个反应, Promega则要求0.5 l 每个反应
14、。理论上每个反应用0.1 l即可切得很好。实际工作中每3-5个反应用1 l 酶是完全可靠的。,DNA酶切注意事项,3. 每一RE生产厂家均有其酶切反应Buffer种类,一般以10浓度提供:如Promega公司的A、B、C、D、E、K、M Buffer,TaKaRa公司的L、M、H、K Buffer。MBI公司的B、G、O、R Buffer。每种Buffer均用固定颜色盖的小管分装。酶有多种,但Buffer只有4-8种,装酶的小管盖的颜色与相应装Buffer小管盖的颜色一致。 4. 双(多)酶切Buffer的选择:相同Buffer;不同Buffer的酶切 5. 选择酶的一个经验:同一厂家越便宜的
15、酶其质量和性能越有保证,因质量和性能好的酶大家用得多,其价格自然便宜。 6. 在多数情况下,一个小时可将DNA切割完全,如若超过2个小时还切割不完全,在酶的质量没有问题的前提下,一般是质粒DNA的纯度不够, 有时用酚-氯仿提抽可解决问题,但多数情况下进一步纯化质粒DNA往往达不到目的(原因不明),明智的选择是重新提取和纯化质粒。,DNA ligase,1、T4 DNA ligase 催化DNA分子的5-P与3-OH之间形成磷酸二酯键。它既能连接粘性末端,又能连接平端,但连接粘端的效率比平端的要高得多。其连接活性多数厂商用Weiss单位()表示, 浓度 一般是1-3 / l。在多数情况下对于DN
16、A重组来说,平端用1 ,而粘端用0.1 即可达到有效连接DNA分子的目的。 2. 大肠杆菌DNA连接酶:一般只能连接粘性末端,不能连接平端,很少使用。,DNA分子的连接:将待克隆的目的DNA片段与载体分子用DNA ligase连接成一个完整的分子。一般重组克隆时载体量用5-10ng即可,外源片段与载体的分子比不低于3,最好在10以上。典型的连接反应是: Buffer 1l或5l 载体 x l 目的DNA片段 x l ligase 0.5-1(单位) 水加至 10l 连接温度为4、16 ,时间 1-12小时不等,按ligase的说明书进行操作即可 注意:如果为粘端连接,应先将载体、目的DNA片段
17、及水先加入到小管中,混匀后置45 、作用5分钟,然后放入冰水中,再加入酶与buffer.,分子生物学其它常用酶,1、Klenow片段 NNGGATCCNNNNNNNNNNCTGCAGNNN NNCCTAGGNNNNNNNNNNGACGTCNNN BamH+Pst GATCCNNNNNNNNNNCTGCA GNNNNNNNNNNG Klenow+dNTP GATCCNNNNNNNNNNC CTAGGNNNNNNNNNNG Klenow用于补平限制酶切割DNA产生的3凹端和削平 3凸端,但后一 作用已被T4噬菌体DNA聚合酶所代替,2、 T4多聚核苷酸激、碱性磷酸酶 T4多聚核苷酸激用于连接但缺乏
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