应用激光显微切割技术研究大鼠短期致肝脏癌前病变机理.doc
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1、 Apply Laser Microdissection Method to Study the Mechanism of Short-term Liver Preneoplastic Lesions in RatsRen jin*, Qi xinming, Liu linlin, Wu xiongfei(Center for Drug Safety Evaluation and Research, Shanghai Institute of Materia Medica, Chinese Academy of Sciences)ABSTRACT OBJECTIVE: To study the
2、 mechanism of liver preneoplastic lesions and the protective effects of resveratrol in short-term liver preneoplastic lesions model in rats with laser microdissection method. METHODS: Male SD rats were treated with diethylnitrosoamine (DEN) and 2-acetylaminofluorene (2-AAF) to induce liver preneopla
3、stic lesions. The placental-type glutathione S-transferase (GST-P) positive altered hepatic foci (AHF) were evaluated as the preneoplastic marker. Oxidative stress, connexin 32 and CYP450 (especially CYP2E1) were also assessed by laser microdissection, immunohistochemical and western blot analysis.
4、RESULTS: 1. The number and area of AHF remarkably increased in the model group (DEN + 2-AAF) and the proliferating cell nuclear antigen (PCNA) also strongly expressed. Taken together, we can say that this model had been effectively built. 2. Reduced glutathione (GSH) was markedly reduced in model gr
5、oup, which indicated the presence of oxidative stress. 3. We used laser confocal microscope to find that the expression of connexin 32 significantly decreased in hepatocytes around central veins. 4. The enzyme activity and protein expression of CYP1A1 and CYP2E1 were up-regulated, while the expressi
6、on of CYP1A2 was down-regulated. We used the laser microdissection instrument to collect the AHF. The expression of GST-P and CYP2E1 was much higher in AHF than the hepatocytes around the AHF. A specific inhibitor of CYP2E1, diallylsulfide (DAS), reduced the expression of CYP2E1, meanwhile, the numb
7、er and area of AHF also decreased. 5. Resveratrol had a similar effect with DAS, which also reduced the expression of GST-P and CYP2E1 in AHF and the hepatocytes around the AHF. The number and area of AHF were also decreased. CONCLUSION: In general, oxidative stress, Cx32 may be involved in the proc
8、ess of preneoplastic lesions. And CYP450 particularly CYP2E1 has a major role in the preneoplastic lesions. Resveratrol has a significant protection on the preneoplastic lesions, which may attribute to CYP2E1.Key words: Short-term Liver Preneoplastic Lesions in Rats, Laser microdissection, CYP2E1, R
9、esveratrol应用激光显微切割技术研究大鼠短期致肝脏癌前病变机理任进* 戚新明 刘琳琳 邬雄飞(药物安全评价研究中心,上海药物研究所,中国科学院,201203)摘要: 目的 建立大鼠短期致肝脏癌前病变模型,采用激光显微切割技术,探讨癌前病变机理和中药白藜芦醇可能的肝细胞保护作用。方法 以大鼠肝脏为靶器官,用已知的致肝癌化合物二乙基亚硝胺(DEN)为诱变剂,以胎盘型谷胱甘肽巯基转移酶(GST-P)标记的转化灶作为肝细胞癌前病变的终点标记,建立短期致肝脏癌前病变模型。同时检测氧化损伤、细胞间隙连接蛋白(Cx32)、CYP450酶等在肝脏细胞癌前病变中的作用。进一步应用激光显微切割技术检测CY
10、P2E1在肝脏细胞癌前病变中的作用。结果 1. 大鼠短期肝脏癌前病变模型的建立 模型组GST-P阳性转化灶数量增多、面积增大,细胞增生指标PCNA阳性细胞数量显著增加,表明模型建立成功。2. 氧化损伤检测 模型组肝脏组织的还原型谷胱甘肽(GSH)明显消耗。3. 细胞间隙连接蛋白(Cx32)的改变 激光共聚焦显微镜观察可见,模型组Cx32蛋白在中央静脉周围肝细胞的阳性染色在面积与数量上都有明显降低。 4. CYP450酶在癌前病变中的作用 模型组CYP2E1和CYP1A1的活性增加,CYP1A1和CYP2E1蛋白表达均上调;CYP1A2则表达下调。进一步用激光显微切割技术,结合连续切片的免疫组化
11、方法,结果表明:转化灶内肝细胞GST-P与CYP2E1的蛋白表达明显高于灶外正常肝细胞。而CYP2E1特异性抑制剂大蒜素(DAS)抑制CYP2E1的表达,同时减少GST-P转化灶的数量和面积。5. 白藜芦醇的肝细胞保护作用 白藜芦醇与DAS作用相似,可以显著的降低灶内、外肝细胞GST-P, CYP2E1的表达,并使转化灶的面积与数目显著减少。结论 综上所述,大鼠短期致肝脏癌前病变模型中,氧化损伤、细胞间连接蛋白可能参与了早期损伤过程;肝脏细胞早期损伤可能与CYP450代谢酶尤其是CYP2E1的改变密切相关。白藜芦醇有明显的肝细胞保护作用,CYP2E1可能在其中起重要作用。关键词:大鼠短期肝脏癌
12、前病变模型 激光显微切割 CYP2E1 白藜芦醇目前国际上常用的检测药物致癌性的实验方法主要是大鼠两年长期致癌实验。该实验的结果可靠,但费时费人工。而体外试验的假阳性和假阴性率较高,难以准确预测药物的致癌性1。因此建立并应用快速、可靠的试验替代模型,结合两年长期致癌试验,是国际上公认的检测化学物质致癌性的有效途径。短期大鼠致肝癌模型是日本学者伊藤等于1989年建立的,用于检测化合物的致肝癌性。该模型自建立以来检测了三百多种化合物,其中,在肝脏致癌物的检测中,有97%的致突变物和88%的非致突变物呈现阳性结果,非肝脏致癌物中,该模型检测的阳性率为21。说明该模型是比较特异的检测肝脏致癌物的试验模
13、型12。应用这一模型也可用于早期致癌机理的研究23,而应用先进的激光显微切割技术,将病变细胞和正常细胞分别切割下来,比较分析RNA、蛋白等的表达差异,可提供最直接的基因、蛋白水平的变化依据,目前广泛认为,这一新技术是将形态学和分子生物学最好的结合方法。但多受昂贵的仪器设备和高难度技术的限制,因而开展的不多。众所周知,绝大多数药物和致癌物通过肝脏进行生物转化,特别是经CYP酶系代谢后可能活化形成毒性较强的产物,对肝脏产生损害。另外,CYP酶代谢后的产物参与基因表达的调控,也参与外源或内源性致癌物前体的生物激活。有报道CYP基因族(即CYP1,CYP2,CYP3,CYP4),承担大量的肝脏内外源性
14、物质的代谢作用,与化学致癌物关系比较密切4 5,但是目前关于CYP450参与肝脏癌前病变的研究并不多,研究较多的是CYP2E1在肝脏癌变过程中起到重要的作用6。在前人研究的基础上,我们采用激光显微切割和连续切片的免疫组化技术研究了CYP450酶尤其是CYP2E1在肝脏癌前病变中的作用。白藜芦醇(Resveratrol, Rev) 化学名称为3, 5, 4三羟基苯二烯,是一种广泛存在于葡萄、虎杖、花生等植物性食物或药物中的多酚类活性单体。近年来大量的体内、体外抗癌试验结果表明,Rev 对多种肿瘤,如肝癌、乳腺癌、皮肤癌、结肠癌等均具有潜在的保护作用。大蒜素(Diallylsulfide, DAS
15、)是多种烯丙基有机硫化物复合物,已证明它是CYP2E1的抑制剂7。有文献报道DAS可以明显的改善DEN引起的肝细胞癌前病变8,在实验中作为阳性对照。本试验首次应用激光显微切割技术,结合连续切片的免疫组化和Western Blotting两种分析方法,观察大鼠短期致肝脏癌前病变模型中,肝脏转化灶内肝细胞和灶外肝细胞GST-P和CYP450蛋白水平的差异,进一步分析和比较了给予Rev后肝细胞转化灶内、外GST-P和CYP2E1蛋白表达不同,表明Rev具有明显的肝细胞保护作用, 而CYP2E1可能在其中起到重要作用。1 材料与试剂1.1实验动物:实验用60只SD大鼠购买于西普尔必凯实验动物有限公司,
16、饲养在中国科学院上海药物研究所的SFP级动物房。1.2主要试剂:二乙基亚硝胺(DEN)、2-乙酰氨基芴(2-AAF)、大蒜素(DAS),p-nitrophenol , ethoxyresorufin, erythromycin购于Sigma。白藜芦醇购买于陕西慧科植物发展有限公司,兔抗GST-P 抗体购于MBL公司,兔抗CYP2E1、CYP2B1/2、CYP1A1、CYP1A2抗体购买于Chemicon公司,鼠抗PCNA、Connexin 32单抗购于Santa Cruz公司,免疫组化ABC试剂盒购买于中衫金桥公司,HRP标记的GAPDH抗体购买于Santa Cruz公司,ECL试剂盒购买于A
17、mersham公司,谷胱甘肽含量测试盒购自南京建成生物工程公司,其他试剂均为上海国药集团生产的分析纯试剂。2 实验方法2.1大鼠短期肝脏癌前病变模型的建立以大鼠肝组织为靶器官,用已知的致肝癌化合物二乙基亚硝胺(Diethylnitrosoamine, DEN)为诱变剂,以2-乙酰氨基芴为促进剂,进行肝脏的大部分切除术,促进肝细胞再生。并以胎盘型谷胱甘肽巯基转移酶(GST-P)阳性结节或病灶为癌前病变的终点标记,用形态学和免疫组织化学的方法检测GST-P和细胞核增生抗原(PCNA)在肝脏转化灶中的分布和阳性率,并进行统计学的分析和比较,判断模型的建立(图1)。图1 大鼠短期肝脏癌前病变模型5周龄
18、大鼠在动物房适应性饲养一周后,给予200mg/kg DEN腹腔注射,在两周时在饲料中混入0.01% 2-AAF,三周时进行肝脏大部切除,八周时将大鼠麻醉处死取材。A 空白对照组,B 给予DEN,不给予2-AAF,C 不给予DEN,仅给予2-AAF,D 模型组,DEN与2-AAF均给予,E 在模型D组的基础上,给予0.1g/kg的Rev灌胃,F在模型D组的基础上,给予0.05ml/2d的DAS灌胃给予。2.2 肝脏组织P450酶及亚型活性的检测我们使用差速离心法分离肝脏微粒体9,分别检测了与致癌密切相关的CYP1A, CYP2E1, CYP2B, CYP3A代谢酶活性: CYP2E1,CYP1A
19、1,CYP3A1等,使用的活性检测底物分别为p-nitrophenol , ethoxyresorufin, erythromycin10。同时使用Western Blotting检测GST-P, CYP1A1, CYP1A2, CYP2E1, CYP2B1/2等的蛋白表达。2.3肝脏组织氧化损伤检测切取100mg肝脏组织,加入10mL 20mM EDTA,高速匀浆。取100 l匀浆液,加入等体积反应溶液(10% 三氯乙酸(trichloroacetic acid,TCA)/20 mM EDTA-Na2),充分混匀后3000g,4oC离心5分钟,取适量上清,加入等体积含0.4 mM Tris-
20、HCl,10 mM 5,5-dithio-bis (2-nitrobenzoic acid) (DTNB),20 mM EDTA-Na2的溶液,在5分钟内读取A412吸收值11。以还原型GSH做标准曲线,方法同上。2.4 Connexin 32免疫荧光染色 我们使用Connexin 32 (Cx32)抗体与Rhodamine标记的二抗进行免疫荧光染色,用甘油封片后,使用Leica TCS2 激光共聚焦显微镜观察,激发波长480nm,发射波长540nm。2.5 免疫组化方法大鼠肝脏石蜡切片,厚度为5um。常规脱蜡、脱水,浸入3%H2O2 10分钟,用10%正常山羊血清37封闭1小时,按照ABC法
21、进行免疫组化染色。染色后的切片用Leica QW550图像分析系统进行着色面积的测定和比较分析。2.6 激光切割技术和方法肝脏组织经OTC包埋、-80冰箱速冻后,用Leica CM3500冰冻切片机制成厚度16um的切片,平铺于附有PET膜的不锈钢框架上,快速H.E染色,显微镜下选择明确的转化灶,使用Leica ASLMD型激光切割仪,将所需肝脏细胞切下,置入不同的50ul离心管,-80保存。按照常规方法提取RNA或蛋白,进行Real-time PCR或Western blotting检测(图2)。图 2 激光显微切割 (HE 20)(A) 快速HE染色切割前的肝脏组织;(B) 红色标记的区域
22、为:疑似转化灶(C) 激光切割 (D) 收集于离心管中的切割组织片。2.7数据管理及统计分析各检查指标数据录入SPSS进行统计学分析。结果用meanSD表示。两组间的比较用t检验或t 检验。计量指标,用单因素方差分析(one way ANOVA)过程进行分析,采用最小显著级差法(LSD)进行各组间比较。计数资料用卡方检验进行比较。显著性标准为p 0.05。3. 实验结果3.1 大鼠短期肝脏癌前病变模型的建立免疫组化和图像定量分析显示,D组可见多量、大的GST-P染色阳性灶,面积与A组相比明显增加(p0.01),PCNA阳性细胞数量明显增加(p0.01)。实验结果说明短期大鼠肝脏癌前病变模型已经
23、成功建立(图 3)(表 1)。IIIIII图 3 短期大鼠肝脏癌前损伤模型I GST-P免疫组化染色 A 空白对照组,D 模型组(DEN+2-AAF)(5)II PCNA免疫组化染色 A 空白对照组,D 模型组(DEN+2-AAF)(10)III GST-P免疫荧光染色 绿色荧光:GST-P,蓝色荧光:DAPI(细胞核染色)表1. GSTP和PCNA免疫组化染色的定量图象分析GroupGST-P foci area (mm2/cm2)PCNA (+)nuclei(1000 cells)ANot detectable31.83 12.89B1.1667.67 45.13C1.08115.58 2
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