棉花体细胞胚发生过程的组织细胞学观察.doc
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1、棉花体细胞胚发生过程的组织细胞学观察曹景林, 张献龙*, 杨细燕, 邓锋林,谭家福,郝娟(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室,武汉 430070)摘 要:以陆地棉品种Coker 201下胚轴为外植体诱导愈伤组织,并以介于30-50目筛之间的胚性愈伤细胞团为材料进行单个细胞团培养,采用石蜡切片法观察棉花愈伤组织诱导和分化过程及体细胞胚发生和发育过程。结果显示棉花胚性愈伤组织有下胚轴两端发生、内发生、非胚性细胞转化、外发生和腺体处发生5种形成途径,其中两端发生和内发生是主要的形成方式;棉花体细胞胚存在单细胞起源,多为表面发生。棉花体细胞胚发育过程中最关键的事件似乎是极性的建立、顶端分生组织的形
2、成以及前形成层的分化和生长轴变化。球形胚时期表皮原层的分化标志着体细胞胚结构分化的开始。初始前形成层的形成是体细胞胚形态转变的第一个信号。球形胚内部等径细胞轴向延长,接着前形成层生长轴发生变化,这些是心形胚或椭圆形体胚中的重要事件。鱼雷形胚基本分生组织中液泡的出现开始了组织分化的过程。对一些停滞发育的球形胚和鱼雷形胚的解剖检查表明,极性建立可能是决定体细胞胚能否萌发的关键因素。关键词:棉花;体细胞胚胎发生;组织细胞学 基金项目:教育部新世纪人才支持计划(NCET-04-0740)作者简介:曹景林(1967-),男,博士,遗传育种专业,现在湖北省烟草科研所工作。*通讯作者(Correspondi
3、ng author):张献龙,男,教授,博士生导师。E-mail:Histo-cytological Observation of Somatic Embryogenesis in Cotton (Gossypium hirsutum L.)Cao Jing-lin, Zhang Xian-long, Yang Xi-yan, Deng Feng-lin, Tan Jia-fu, Hao Juan (National Key Laboratory of Crop Genetic Improvement, Huazhong Agricultural University, 430070, Wuh
4、an,Hubei, China)Abstract:Calli were induced from hypocotyl explants of cotton cultivar Coker 201, and individual embryogenic cell clusters with 3050 mesh sieve, which isolated from embryogenic suspension cultures, were cultured. The development of the calli and single few-celled aggregates was obser
5、ved through paraffin sections. The results revealed 5 pathways of embryogenic calli origination including origination from both ends of hypocotyls, origination in inner, differentiation from non-embryonic cells, origination from outer cells of calli, and origination in the surrounding of gland. Amon
6、g these, the origination from both ends of hypocotyls and in inner were the most important pathways. Cotton somatic embryos originated from individual embryogenic cells, which were in exterior of embryogenic calli in most cases. The most critical events appeared to be the establishment of apical-bas
7、al patterns of symmetry, formation of apical meristems, and differentiation and axial change of procambium during the development of cotton somatic embryos. Differentiation of the protoderm layer marked the beginning of the structural differentiation in globular stage. Incipient procambium formation
8、 was the first sign of somatic embryo transition. Axial elongation of inner isodiametric cells of the globular somatic embryo followed by the change in the growth axis of the procambium was an important event in heart-shaped or oblong-stage somatic embryo. Vacuolation in the ground meristem of torpe
9、do-stage embryo began the process of histodifferentiation. Histological observations of some globular and torpedo-shaped embryos which faired to advance showed that establishment of polarity was the key factor which determined germination of somatic embryos.Keywords: Cotton; Somatic embryogenesis; h
10、isto-cytology体细胞胚胎发生是指与原始组织不存在微管束联系的非合子细胞发育成一个类似合子胚的极性结构的过程1,2,它经历了与合子胚发生类似的关键阶段:球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶成熟胚1。这个过程也是展示植物细胞如何首先分化然后重新决定向胚性途径发展而呈现全能性的一种方式1。作为20世纪后期植物组织培养中的一个重大发现和突破,体细胞胚胎发生体系在植株再生、病毒脱除、细胞融合、基因工程等领域中具有广泛的应用。然而,由于不同物种,甚至同一物种的不同基因型在体细胞胚诱导、体细胞胚的同步发育以及体细胞胚的成熟等各方面对培养条件的要求不同,而使其潜力难以充分发挥。近年来,棉花体细胞胚胎发生
11、和再生技术得到了明显改进3-5,但对棉花体细胞胚胎发生机制的研究较少6,7。棉花的再生过程主要是通过诱导愈伤组织产生体细胞胚,由体细胞胚发育成再生苗。在此过程中了解愈伤组织和体细胞胚的发生及生长过程对研究棉花体细胞胚的发生机理及进一步改进再生体系有很大帮助。目前,尽管有一些关于棉花体细胞胚胎发生过程的显微观察报道6,8-11,但系统的组织学研究报道尚未见到。因此,本研究采用石蜡切片技术,研究体细胞胚的发生特征,以期从细胞学水平上认识体细胞胚的发生特点,为进一步提高再生效率研究提供依据。1 材料与方法1.1 愈伤组织的诱导和继代培养以陆地棉品种Coker201为供试材料,由华中农业大学棉花育种室
12、提供。棉花品种Coker201的成熟种子经去壳消毒后,种植在1/2MS培养基上,于281 下暗培养7 d左右,获无菌苗。取无菌苗下胚轴切成0.5 cm左右的小段,平放于愈伤诱导培养基(MS无机盐,B5有机物,0.45 molL-1 2,4-D,0.46molL-1 KT,0.1% (w/v) MgCl26H2O,3% (w/v) glucose)上。诱导35 d左右将愈伤组织转移到2,4-D减半的愈伤诱导培养基上继代培养。以后每28 d继代1次,直至愈伤组织发生肉眼可见的胚分化。把胚性愈伤组织转入分化培养基(MS无机盐,无NH4NO3而KNO3加倍,B5有机物,2.46 molL-1 IBA
13、,0.70 molL-1 KT,0.1% (w/v) Glu,0.1% (w/v)Asn,3% (w/v)glucose),每28 d继代1次。愈伤的诱导和分化培养于282,光照强度(冷光源)135molm-2s-1,每天光照14 h的条件下进行。每两天取一次样放入FAA固定液中固定以供组织分析。1.2 胚性愈伤组织的悬浮培养胚性愈伤组织继代培养23次后,转入不含激素和Phytagel的分化培养基(补加0.1% (w/v) KCl)中悬浮培养。首先选取生长稳健、状态疏松的小米粒状米黄色胚性愈伤组织转入盛有40 mL培养基的100 mL锥形瓶(约2 g/瓶)中,温度282、120 rpm振荡培养
14、2 d,以获得分散的细胞培养物,然后过30目筛,去除大颗粒。然后将每2 mL PCV(packed-cell-volume)胚性愈伤转入盛有40 mL 新鲜培养基的锥形瓶中,继续在温度282下,120 rpm振荡避光培养。每周更换悬浮培养液1次。1.3 胚性细胞团的固体培养胚性愈伤组织悬浮培养14 d后,再次过30目筛,滤液再过50目筛,收集筛上部分,重新悬浮于新鲜培养基中,用一个长而尖嘴的吸管吸取含愈伤组织的悬浮液均匀喷布在无菌滤纸上。然后挑取单个的胚性愈伤团转到培养皿中的固体分化培养基(附加2.46 mol L-1IBA,0.70mol L-1 kinetin和0.1% (w/v) KCl
15、)上继续培养。继代后用封口膜密封,然后于282 、光照强度(冷光源)135 mol m-2 s-1、每天光照14 h的条件下进行培养。每皿继代20个胚性愈伤团。每两天取样1皿于Leica MZ FL 体视显微镜下检查胚胎发育进程,并在不同发育阶段取培养物按愈伤团分别放入FAA固定液中固定以供组织分析。每个阶段开始前后每2 d 取样一次固定,缓慢阶段5 d 取样一次固定。1.4石蜡切片制样与观察将待观察的组织取样后放入FAA固定液(福尔马林(formalin):乙酸(acetic acid):乙醇(alcohol)=5:5:90)1,2中,室温下固定48 h以上。将固定好的组织投入苏木精染液中,
16、染色3 d后用蒸馏水漂洗过夜。然后通过以下浓度梯度的乙醇进行脱水:30% 3 h,50% 3 h,70% 3 h,85% 3 h,95% 1 h,100% 30 min,100% 30 min。接着进入以下浓度梯度的二甲苯进行透明:30%(二甲苯/氯仿)2.5 h,50% 2.5 h,75% 2.5 h,100% 1 h,100% 1 h。然后再在以下梯度浓度的石蜡中浸蜡:15%(石蜡/二甲苯)3 h,30% 3 h,50% 2.5 h,75% 2.5 h,100% 50 min,100% 50 min,最终包埋在100%的石蜡中。包埋好的组织用旋转切片机(KD 2508, KEDEE, Ch
17、ina)切成10m厚的连续切片,封片后进行组织学观察。切片在显微镜(DM 2500,Leica,Germany)下观察并照相。2 结果与分析2.1 愈伤组织诱导和分化过程的组织细胞学观察棉花下胚轴外植体(图1-A)在培养的第3 天就能观察到两端开始膨大, 切口处开始有愈伤组织形成(图1-B1、B2),石蜡切片观察表明,这些愈伤组织是由胚性细胞和非胚性细胞组成的(图1-B1、B2),这说明二者有可能是同时产生的。纵切面观察还表明,切口形成层处有胚性细胞形成(图1-B2),说明两端产生的胚性细胞可能来自于形成层,而非胚性细胞是由皮层细胞分化形成的。到第5天能够观察到皮层细胞进一步膨涨,分化形成大量
18、的非胚性愈伤组织(图1-C1)。这些非胚性愈伤组织迅速扩增繁殖,将胚性细胞组成的胚性愈伤组织包裹在愈伤组织内部,但仍有少量的胚性细胞裸露在愈伤组织表面(图1-C2、C3)。组织学观察表明,非胚性愈伤组织的细胞形态大而不规则,细胞核小、位于细胞边缘,细胞质稀薄,细胞壁薄,细胞含水量大,往往会因为制样过程中的脱水作用而变形。胚性愈伤组织结构比较致密, 细胞核大,体积较非胚性细胞小,排列紧密(图1-C2、C3)。随后,下胚轴整个小段的皮层细胞膨涨变软,分化形成非胚性愈伤组织,而两端的胚性愈伤组织细胞以平周分裂方式迅速扩增繁殖,向外推挤(图1-F1、F3),一般在培养27 d后,这些胚性愈伤组织就已经
19、能够在愈伤组织表面肉眼可辨(图1-F2)。观察还发现,愈伤组织也主要以内发生形式形成。纵切面观察表明,在下胚轴诱导培养5-7 d时,整个小段的形成层细胞开始不连续的直接分化形成胚性细胞(图1-D1),这些胚性细胞以平周分裂方式迅速往外扩增(图1-D2),诱导培养9-11 d时,可以观察到在优先产生胚性细胞的区域形成一个个的胚性愈伤组织突起(图1-D3)。横切面观察表明,这些愈伤组织主要在形成层周边的4个两两对称点处分化形成(图1-E1),这些点处产生的胚性细胞迅速往外分裂扩增,新形成的胚性细胞又迅速向周边分裂扩增(图1-E2、E3),进而沿下胚轴方向形成4个曲曲折折的胚性愈伤组织区域带(图1-
20、D3、E1),这些愈伤组织区域带进一步向外推移,最后推挤到愈伤组织表面,肉眼可见。图1 棉花下胚轴诱导愈伤过程中胚性愈伤组织的两端发生和内发生Fig. 1 Origination of embryogenic calli from both ends of hypocotyls and in inner during induction of calli from hypocotyl explants of cotton.A:诱导当天的下胚轴纵切面;B1-B2:诱导第3天下胚轴纵切面;C1-C3:诱导第5天下胚轴纵切面;D1:诱导第5天下胚轴纵切面;D2:诱导第7天下胚轴纵切面;D3:诱导第1
21、1天下胚轴纵切面;E1-E2:诱导第15天下胚轴横切面;E3:内发生胚性愈伤组织突起的横切面;F1-F3:诱导第27天下胚轴纵切面。A: Vertical section of hypocotyl on the day of initial induction; B1-B2: Vertical section of hypocotyl on the 3rd day of induction; C1-C3: Vertical section of hypocotyl on the 5th day of induction; D1: Vertical section of hypocotyl on
22、 the 5th day of induction; D2: Vertical section of hypocotyl on the 7th day of induction; D3: Vertical section of hypocotyl on the 11th day of induction; E1-E2: Transverse section of hypocotyl on the 15th day of induction; E3: Transverse section of protuberant embryogenic calli originated in inner;
23、F1-F3: Vertical section of hypocotyl on the 27th day of induction.石蜡切片观察还表明,在非胚性愈伤组织内部,部分长形或长椭圆形的非胚性细胞通过活跃的有丝分裂活动、快速的细胞分裂和增殖,可以转化为椭圆形、近圆形的胚性细胞(图2-A、B)。这些胚性细胞进一步分裂,形成胚性愈伤组织细胞团(图2-C、D、E、F),这些胚性愈伤组织细胞以平周、垂周或任意方向迅速分裂,扩大胚性愈伤组织区域(图2-C、D、E、F、G、H、I)。但观察表明,胚性愈伤组织的这种形成方式并不是主要的。图2 棉花下胚轴诱导愈伤过程中部分非胚性愈伤组织细胞分化为胚性愈
24、伤组织Fig. 2 Differentiation of embryogenic calli from non-embryonic cells during induction of calli from hypocotyl explants of cotton.A-B:非胚性细胞分化形成的胚性细胞;C-I:胚性细胞不同方向分裂形成的胚性愈伤组织。A-B:Embryogenic cells differentiated from non-embryonic cells; C-I: Embryogenic calli from embryonic cells dividing at differ
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