玉米赤霉烯酮降解酶多拷贝表达载体构建及其毕赤酵母高效表达.doc
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1、多拷贝玉米赤霉烯酮降解酶在毕赤酵母的分泌表达王义春 江均平* 通讯作者,E-mail: (农业部农产品加工综合性重点实验室,中国农业科学院农产品加工研究所,北京 100193)摘要:本研究通过多拷贝克隆技术实现玉米赤霉烯酮(Zearalenone, ZEN)降解酶基因(zlhy-6)在巴斯德毕赤酵母中的高效分泌表达。基因序列根据酵母密码子偏爱性优化后与因子信号肽编码序列一起合成(即-zlhy-6),插入到 pA0815 中,并构建 pA0815-(-zlhy-6)4 多拷贝表达载体,转化毕赤酵母 GS115 后进行诱导表达,并对表达产物进行鉴定。结果表明,酶切证实成功构建了-zlhy-6多拷贝
2、毕赤酵母表达载体 pAO815-(-zlhy-6)4,利用 SDS-PAGE 法检测到表达产物在 30 kDa 附近出现条带,与预期值相符。活性测定表明重组酶具有较高降解 ZEN 的能力。重组酶对水溶液中 ZEN 的降解率可达到 97.5% 以上,对玉米碴中 ZEN 的降解率达到 75.51% 左右。关键词:玉米赤霉烯酮;降解;基因表达;毕赤酵母Construction of a Multi-Copy Secretory Expression Vector and Expression of ZEN Degradation Enzyme in Pichia pastoris Wang Yich
3、un, Jiang Junping* Correspondence author ,通讯作者, E-mail: (Key Laboratory of Agro-Products Processing, Ministry of Agriculture, Institute of Agro-Products Processing Science & Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing, 100193)Abstract: In this work, a multi-copy method for secrete
4、d expression of Zearalenone degradation enzyme encoded by zlhy-6 was developed. Zlhy-6 optimized according to codon preference of Pichia pastoris was syntheticed along with alpha () signal peptide gene and cloned into pAO815. The multi-copy expression vector pAO815-(-zlhy-6)4 was constructed. The re
5、combinant was transformed into P. pastoris strain GS115 for induction expression and then the activity of secreted products was identified. According to the results, a new multi-copy vector pAO815-(-zlhy-6)4 was successfully constructed and was capable of secreting recombinant enzyme efficiently, wh
6、ich was confirmed by enzyme digestion and SDS-PAGE respectively. The recombinant enzyme possessed high activity of ZEN-degradation. The degradation rate of 97.5% and 75.51% were achieved in the aqueous solution and in the corn, respctively.Key words: Zearalenone; Degradation; Gene expression; Pichia
7、 pastoris; 玉米赤霉烯酮(Zearalenone,ZEN),又称F-2毒素,2,4-二羟基苯甲酸内酯类化合物,主要由禾谷镰刀菌产生的一种霉菌毒素。ZEN具有雌激素活性,对生殖发育系统有毒害作用。摄入ZEN超标的母猪会出现外阴和乳腺肿大甚至阴道及直肠脱垂的症状1。ZEN有致癌性,能导致DNA收敛、染色体断裂2,还可能通过雌激素受体通路和抑制凋亡促进人神经母细胞瘤 SK-N-SH 细胞的体外增殖3。Jian Ying等4研究发现ZEN能导致老鼠变态数精子增加、精子的活力下降同时受孕降低。梁梓森等5研究证明ZEA有血液毒性,小鼠试验中,ZEN可导致淋巴细胞明显减少(P0.05),白细胞及其
8、他各组分细胞升高,血小板数量明显减少。目前ZEN的降解方法主要有物理法(高压加热6、辐照7、吸附剂吸附8)、化学法(加臭氧、双氧水和碳酸钠处理9-11)和生物法(微生物菌体吸附、酶降解)。传统的物理化学方法有一定局限性,如破坏营养物质、引入化学物质造成再次污染等。而生物学方法具有反应条件温和、无化学试剂残留等优点,因此受到人们广泛关注。近年来,随着生物技术的发展,ZEN的生物降解有了一定进展。不少能降解ZEN的菌被分离找到,其中一些关键酶的基因已被克隆表达。来自粉红粘帚霉的ZEN降解酶基因zhd101、zlhy-6、ZEN-jjm被成功克隆表达,重组蛋白均表现出较强的水解ZEN的能力12-15
9、,被转入ZEN降解酶基因的玉米也表现出降解ZEN的能力16。Tang等从一株不动杆菌成功克隆了一个抗氧化酶基因,重组酶有降解ZEN的能力,一定浓度H2O2能提高其水解ZEN的能力17。外源基因在酵母中的表达水平的高低受诸多因素的影响。其中,密码子的偏好性和基因表达量密切相关,在宿主菌中表达量高的基因通常采用宿主菌所偏爱的密码子。Andrea Mellitzer等18研究表明,使用不同的密码子,外源基因的表达量不同。此外,外源基因的表达量与其在宿主中的基因拷贝数也密切相关,一般情况下, 毕赤甲醇酵母中外源基因整合的拷贝数愈多蛋白表达量愈高。巴斯德毕赤酵母表达系统是目前使用最多、最广泛,被认为最理
10、想的生产外源蛋白的工具之一,已成功表达1000多种外源蛋白 19-20 。毕赤酵母表达载体pAO 815是常用的胞内表达载体,它能实现体外构建多拷贝,即在构建表达载体上,就含有多个拷贝的外源基因,提高整合时产生多拷贝的概率,从而提高目标蛋白的表达量。但是,该载体没有分泌信号,其表达产物存在于酵母细胞内,不但容易被降解,也不便于分离和纯化。为得到一个表达量更高、产物更易于分离纯化的ZEN降解酶表达系统,本试验以zlhy-6为目标基因,对pAO 815 和外源基因进行改造和构建。1 材料与方法1.1 材料1.1.1质粒和菌株基因zlhy-6按酵母偏爱密码子进行优化,由无锡青兰生物技术有限公司合成;
11、E. coli TOP10感受态细胞,购自北京全式金公司;酵母表达载体pAO815、Pichia pastoris GS115,由本实验室保存。1.1.2 试剂限制性内切酶(EcoR、Bgl、BamH、Sal)、PfuDNA聚合酶、T4 DNA连接酶等,日本TaKaRa公司;PCR产物纯化试剂盒、DNA胶回收试剂盒,北京三博远志公司;YNB, BD公司;D-山梨醇,德国Sigma公司;乙腈、甲醇(色谱级),美国Fisher公司;其他分析纯试剂,国药集团化学试剂有限公司。1.1.3 仪器与器材紫外凝胶成像仪,美国Alpha Innotech公司;凝胶电泳仪,北京百晶生物技术有限公司;高速冷冻离心
12、机,德国Eppendorf公司;PCR扩增仪,日本TAKARA公司;高效液相色谱仪,美国Waters公司;C18液相色谱柱,美国 Agilent公司;电击转化仪,美国BTX公司;恒温振荡摇床,上海智诚公司。1.2 方法1.2.1 表达载体的构建1.2.1.1单拷贝表达载体构建利用化学方法合成信号肽编码序列和玉米赤霉烯酮降解酶基因zlhy-6,即-zlhy-6,并在基因两端引入EcoR酶切位点。其中,ZEN降解酶基因按照酵母密码子偏爱性进行优化。合成的基因片段和载体pAO815用EcoR酶切处理,并用凝胶回收试剂盒进行纯化回收。酶切体系20 L:质粒或目的片段10 L,10H Buffer 2
13、L,EcoR1 L,ddH2O 7 L。体系混匀后37 C反应3 h。回收的目的片段和载体按摩尔比3:1用T4连接酶进行连接。连接反应体系10 L:目的片段3 L,载体4 L,10T4 连接酶缓冲液1 L,T4连接酶1 L,16 C连接过夜,连接产物转化大肠杆菌TOP10,用氨苄青霉素筛选阳性克隆。然后测序,选择插入pAO815的-zlhy-6为正向的克隆。得到的重组质粒(pA0815 l-zlhy-6)作为-zlhy-6表达框(5AOX-zlhy-6-3AOX-TT3) 的来源用于构建后面的多拷贝表达质粒。1.2.1.2 多拷贝表达质粒的构建引物P1/P2:GGAAGATCTAACATCCA
14、AAGACG/ TAGGATCCGCACAAACGAAC,引物两端引入了Bgl、BamH酶切位点。以重组质粒pA0815 l-zlhy-6为模板,用引物P1/P2 PCR扩增得到完整表达框5AOX-zlhy-6-3AOX-TT3。PCR反应条件:95 预变性5 min,(95 C 30 s,56 C 30 s,72 C 60 s)共35个循环,72 C延伸7 min。试剂盒纯化回收扩增产物并连接到pGM-T载体上,转化后,过夜培养,挑取6个阳性克隆,经测序与合成基因片段一致。连接到pGM-T的表达框经Bgl、BamH双酶切后,试剂盒回收。得到的表达框与经BamH酶切处理并用CIP去磷酸化的单拷
15、贝pA0815表达载体连接,转化TOP10,提质粒酶切鉴定筛选到2拷贝质粒pA0815 2-zlhy-6。用Bgl、BamH双酶切2拷贝质粒,回收得到两个串联的表达框,再与经BamH酶切处理并用CIP去磷酸化的质粒pA0815 2-zlhy-6连接,转化TOP10,提取质粒进行酶切鉴定。1.2.2 重组表达载体转化毕赤酵母GS1151.2.2.1毕赤酵母GS115感受态的制备酵母GS115单菌落转移到5 ml YPD培养基中,30 C,250 r/min过夜培养。取100 L过夜培养液于50 mL新鲜YPD培养基中,30 C,250 r/min培养至OD600=1.31.5(1216 h)。4
16、 C、5000 g离心5 min收集菌体;50 ml预冷蒸馏水洗涤一遍,5000 g离心5 min收集菌体;加入50 ml LiAc-DTT溶液(100 mM LiAc,10 mM DTT,0.6 M山梨醇,10 mM Tris-HCl,pH 7.5)混匀,室温下放置30 min,5000 g离心5 min,菌体用5 mL冰浴的1 M山梨醇洗涤两次,最后1.5 mL 1M山梨醇重悬,按每管80L分装。1.2.2.2 线性化重组质粒的电击转化构建好的表达载体pA0815 4-zlhy-6用Sal线性化后回收。取15 g与80 L感受态细胞转入0.2 cm电击杯中混匀,冰浴5 min进行转化,同时
17、以空载体pA0815作阴性对照。电转条件:电压1.5 kV,电容25 F,电阻200 。电击后立即加入1 mL冰浴的1M山梨醇,转入1.5 mL离心管,30 C孵育1 h。取菌悬液20 L涂布于MD平板,将平板倒置于30 C培养3 d,观察转化子。1.2.3 重组蛋白的诱导表达筛选及鉴定随机挑取MD平板上的单菌落分别接种于5 mL BMGY培养基中,30C、250 r/min培养36 h,5000 g室温离心5 min收集菌体。菌体用2 ml BMMY培养基重悬,30 C、250 r/min诱导培养3 d,期间每隔24 h补加甲醇至0.5%,培养结束后,12000 g离心5 min收集上清液进
18、行SDS-PAGE电泳筛选。重组蛋白由北京蛋白组研究中心采用串联质谱(MS-MS)进行分子鉴定。1.2.4 重组蛋白诱导时间和表达量分析成功表达重组蛋白的酵母接种于50 mL BMGY培养基中,30 C、250 r/min培养OD600至26,收集菌体。将菌体转移至20 mL BMMY 培养基中,30 C、250 r/min诱导培养5 d,期间每隔24 h取样,并补加甲醇至终浓度0.5%。取15 L样品进行SDS-PAGE检测,利用凝胶图像分析软件 BandScan 5.0对重组蛋白的总灰度进行分析。将诱导培养1 d 的蛋白的灰度值设为100,计算其余时间的蛋白灰度值的相对变化率。 1.2.5
19、 重组蛋白ZEN降解活性分析1.2.5.1 水溶液中ZEN的降解取成功表达蛋白和对照菌株的酵母上清液对ZEN进行降解。反应体系500 L:上清液50 L;0.5 mg/mL ZEN 20 L; 0.05 M Tris-HCl(pH7.5)470 L。反应体系混匀后37 C反应02 h加入等体积甲醇终止反应,利用HPLC检测ZEN残留量。1.2.5.2玉米碴中ZEN的降解 用pH7.5 Tris-HCl缓冲液将酶液分别稀释2、5、10倍。按照发酵液与玉米碴(v:w)1:1的比例混合均匀(即酶液添加量分别为1/10、1/5和1/2),37 C,240 rpm条件下进行反应,0、3、6、12、24
20、h定时取样。按照GB / T 235042009提取样品中的ZEN,进行HPLC检测。1.2.6 ZEN的HPLC检测条件高效液相色谱条件为:C18色谱柱(4.6 mm150 mm,5 m);荧光检测器 2475型:激发波长274 nm,发射波长440 nm;柱温:30 ;流动相:乙腈-水(60:40, V:V);流速:1.0 mL/min,进样体积20 L。 2结果与讨论2.1表达载体的构建和鉴定玉米赤霉烯酮降解酶基因zlhy-6按照酵母密码子偏爱性进行优化与信号肽合成得到的基因片段-zlhy-6酶切回收,与经同样酶切的pA0815连接,转化大肠杆菌TOP10。用氨苄青霉素筛选到阳性克隆,回
21、收完整表达框后经过反复酶切、酶连、转化筛选得到4拷贝表达载体,见图1 。重组质粒经BamH单酶切、Bgl/BamH双酶切进行验证。结果如图2所示,重组质粒的片段大小约16 kb,经BamH单酶切线性化后,电泳显示片段大于15kb。进一步用Bgl/BamH双酶鉴定,产生了3个片段:9.4 kb(含有4个串联的-zlhy-6表达框),4.0 kb和2.4 kb。结合质粒pA0815、 pA0815 1-zlhy-6的BamH单酶切和Bgl/BamH双酶切结果可以判断,我们成功构建了4拷贝表达载体pA0815 4-zlhy-6,在该质粒中串联着4个-zlhy-6表达框。BamH/ BglBglBam
22、HSalStuBglBamH/ BglBamH/ Bgl图1 pA0815-(-zlhy-6)4质粒的构建Fig.1 construction of plasmid pA0815-(-zlhy-6)4 图2(a)重组质粒的单酶切分析电泳图 图2(b)重组质粒的单酶切分析电泳图Fig.2 Restriction endonucloase analysis of recombinant plasmids注:图2(a): M: DNA marker DM15000; 1:pA0815; 2: pA0815 4-zlhy-6经BamH酶切图2(b): M: DNA marker DM10000, 1:
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