琼脂糖微球的制备及活化条件研究.doc
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1、广西大学本科毕业论文 琼脂糖磁性微球活化条件研究 - I - 摘要 一般说来,琼脂糖磁性微球活化度越高,能连接的亲和配位体就越多, 用其吸附纯化蛋白质及固定化酶效率就越高。本实验研究了用环氧氯丙烷 活化琼脂糖磁性微球的最优条件。实验先用反相悬浮包埋法制备出琼脂糖 磁性微球,微球因内部含有磁性四氧化三铁的超细粉末而具有磁响应性。 以微球表面的环氧基密度作为活化度的度量,考察了 NaOH 浓度、环氧氯 丙烷体积分数、NaBH4的浓度、活化温度和活化时间等因素对琼脂糖磁性 微球活化反应活化度的影响,得到了最佳活化条件为:NaOH 溶液浓度为 0.9mol/L,环氧氯丙烷体积分数为 40%,NaBH4
2、的浓度为 0.5g/L,活化温度 为 40,活化时间为 4h。用环氧氯丙烷活化的载体稳定性好,且可提供相 当于 3 个碳原子间距的空间臂。本文还研究过相似活化步骤和条件下,改 用 1,4-丁二醇二缩水甘油醚做活化剂,但未能成功活化琼脂糖磁性微球,该 研究尚待进一步开展。 关键词:琼脂糖 磁性微球 活化 广西大学本科毕业论文 琼脂糖磁性微球活化条件研究 - II - Abstract Generally speaking, the higher the activation degree of agarose magnetic microspheres is, the more affinity
3、 ligands can be grafted. So that the adsorptive capacity of microspheres for protein purification and the efficiency of immobilized enzyme can be higher. This paper investigated optimal conditions for the activation of agarose magnetic microspheres, using epichlorohydrin as activating agent. Firstly
4、, agarose magnetic microspheres were prepared by reverse suspended embedding method. The microspheres possessed magnetic responsibility because of the interior Fe3O4 ultrafine powder. The effects of sodium hydroxide concentration,epichlorohydrin volume fraction,NaBH4 concentration,activation tempera
5、ture and activation time on activation degree were investigated,according to the density of surface epoxy group . The optimal conditions are obtained as followed:sodium hydroxide concentration,epichlorohydrin volume fraction, NaBH4 concentration ,activation temperature and activation time is 0.9 mol
6、/L, 40%, 0.5 g/L, 40 , 4 h, respectively. The carrier activated by epichlorohydrin can be of good stability and has 3 carbon atom space arm. This paper also studied the activation of agarose magnetic microspheres using 1, 4-butyl glycol two glycidyl ether as activating agent. The experiments in whic
7、h agarose magnetic microspheres were failed to be activated were operated under similar methods and conditions. The relevant researches are yet to be further developed. Keywords:Agarose; magnetic microspheres; activation 广西大学本科毕业论文 琼脂糖磁性微球活化条件研究 - III - 目录 摘要 .I ABSTRACT.II 目录.III 第一章 文献综述.1 1.1 固定化
8、酶技术的研究意义.1 1.2 固定化酶载体基质材料.2 1.2.1 固定化酶载体基质材料性质要求.2 1.2.2 固定化酶载体材料研究进展.2 1.3 固定化酶载体的表面修饰.3 1.3.1 固定化酶载体表面修饰原则.3 1.3.2 固定化酶载体表面修饰环氧基.4 1.4 固定化酶载体的间隔臂.6 1.5 固定化酶载体的配位体.7 1.6 展望.7 1.7 本论文研究内容及意义.7 第二章 琼脂糖微球的制备.9 2.1 实验试剂及仪器.9 2.1.1 实验试剂.9 2.1.2 实验仪器.9 2.2 实验方法及步骤.10 2.3 实验结果及讨论.10 第三章 琼脂糖磁性微球活化条件研究.12 3
9、.1 微球活化方法论证.12 3.2 环氧基分析方法论证.12 3.3 实验试剂及仪器.13 广西大学本科毕业论文 琼脂糖磁性微球活化条件研究 - IV - 3.3.1 实验试剂.13 3.3.2 实验仪器.14 3.4 实验方法及步骤.14 3.4.1 琼脂糖磁性微球的活化.14 3.4.2 琼脂糖磁性微球环氧基修饰密度的分析.15 3.5 实验结果及分析.15 3.5.1 活化后琼脂糖磁性微球的性质.15 3.5.2 琼脂糖磁性微球活化条件探究结果分析.16 3.5.2.1 氢氧化钠溶液浓度的影响.16 3.5.2.2 环氧氯丙烷体积分数的影响.17 3.5.2.3 硼氢化钠的浓度的影响.
10、18 3.5.2.4 活化温度的影响.18 3.5.2.5 活化时间的影响.19 第五章 全文总结及展望.21 5.1 全文总结.21 5.2 展望.21 参考文献.23 致谢.25 附录:外文文献翻译26 广西大学本科毕业论文 琼脂糖磁性微球活化条件研究 - 1 - 第一章 文献综述 1.1 固定化酶技术的研究意义 酶作为生物催化剂,因具备底物特异性、位置特异性、立体特异性等 催化特点,且催化过程中具有极高的选择性、催化反应、条件温和、无污 染等诸多优点,所以在油脂加工、去污剂与脱脂、食品加工与饲料、精细 化工、医药、造纸业、化妆业、皮革加工、生物柴油、生物降解等诸多领 域有着广泛的应用1。
11、然而,要把酶投入到生物化工工业中,酶的稳定性、 活性和复用性亟待提高。因此固定化酶一直是酶技术的热门研究课题。人 们提出了很多固定化酶的方法,比如物理吸附法、共价结合法、聚合物包 埋法、交联法、氨基酸置换法和抗体偶联法等2。 酶的固定化是指将酶束缚于一定的区域内,能连续进行其特有的催化 反应,并可回收和重复使用的一类技术。其实固定化酶可以看作是通过化 学或物理的处理方法,使原来水溶性的酶与固态的水不溶性支持物相结合 或被载体包埋。因此,酶固定化的广泛概念应为:利用物理或化学方法处 理,将游离酶限定或束缚于一定范围之内使其与整体流体分开,但仍能发 挥催化作用的酶制剂。该过程将酶从单相催化剂形态转
12、变为复相催化剂形 态3。制备固定化酶的过程被称为酶的固定化。经过固定化,酶具有了比原 来水溶性游离酶更多的优点: (1)固定化酶对热、pH 等的稳定性有较大提高,有的酶具有了抗蛋白酶 分解的特性; (2)反应完成后经过简单分离,酶就可与底物、产物分开并回收,而且 酶活力降低较少; (3)固定化体系适合于连续化、自动化生产,可以在较长时间内进行反 复分批反应和装柱连续反应,催化过程容易控制,后处理过程简单,提高 了酶的利用效率,降低了生产成本4、5。 广西大学本科毕业论文 琼脂糖磁性微球活化条件研究 - 2 - 1.2 固定化酶载体基质材料 1.2.1 固定化酶载体基质材料性质要求 作为固定化酶
13、的一部分,载体材料的结构和性能对固定化酶的各种性 能都有着巨大的影响。优良的亲和基质应满足以下几点要求: (1)载体材料应带有能与酶发生反应的官能团,如-OH、-COOH、-CH 等反应性基团,这样可大大提高载体材料与酶之间的结合力,同时亦可提 高固定化酶的操作性和稳定性; (2)好的载体材料应具有大的比表面积和多孔结构,从而易和酶相交联, 并可提高固定化率; (3)一般来说,载体材料要求是不溶于水的。这不仅可防止酶失活,还 可防止酶受到污染; (4)机械刚性及其稳定性是载体材料非常重要的性质。由于固定化酶的 一个最大的特点是要能重复使用,这就要求载体材料的机械刚性和稳定性 都非常好; (5)
14、材料的粒径越小,其比表面积就越大,与自由酶固定化程度就越高, 固定化率也就越高; (6)在长时间的使用中,载体材料必须要能防止微生物的降解作用; (7)再使用性。 此外,随着人们对公共卫生和环境保护的日益关注,要求载体材料无 毒、可降解;而从成本上来考虑,还要求载体材料经济、来源丰富6。 1.2.2 固定化酶载体材料研究进展 最早使用的基质是以琼脂糖为代表的多糖类软胶。Polson(1961)最先 对粒状琼脂糖凝胶优良的性质作出高度评价。在适当条件下,琼脂糖凝胶 既可对交联葡聚糖不能分离的高分子进行分离,又具有良好的机械稳定性7。 现在常见的琼脂糖凝胶柱有 Sepharose CL-4B,6B
15、 等。目前,多糖类凝胶仍 是应用最广的亲和纯化基质。 近年来新兴的新载体材料为复合载体材料。其是以有机材料和无机材 广西大学本科毕业论文 琼脂糖磁性微球活化条件研究 - 3 - 料复合组成的。以磁性高分子微球作为典型代表。它是一种内部含有磁性 金属或金属氧化物的超细粉末从而具有磁响应性的高分子微球。磁性高分 子微球可以通过共聚、表面改性等化学反应方法在微球表面引入多种反应 性功能基团(如:-OH、-COOH,-NH2、-COH 等),也可以通过共价键来结 合酶、细胞、抗体等生物活性物质。因其内部有磁性物质存在,在外加磁 场的作用下,可快速有效地富集、分离、回收和再利用。与其它载体材料 相比,磁
16、性高分子微球作为固定化载体具有从反应体系中易分离和回收、 操作简便、成本较低等诸多优点,因此引起了国内外许多学者的广泛关注7。 人们已经成功用化学共沉淀法、沉淀氧化法、超声沉淀法、生物合成 法、电热化学法、与天然生物大分子、合成高分子反应,辐射聚合、 ATRP/DPE 可控制备法、与无机物反应的方法制备出纳米级的磁性复合微 球8。 另外其他载体材料的研究和开发也取得了可喜进展。如 Ding Lianggi 等9对聚苯乙烯这种有机高分子载体的亲水性改性,并用其固定化木瓜蛋白 酶;Suye10则将葡萄糖氧化酶固定在改性聚碳酸酯膜上(膜预先用氨基甲酸 乙酯和 L-赖氨酸改性,并用戊二醛活化)。这种固
17、定化酶的热稳定性和 pH 稳定性大大优于天然酶。这种载有酶的膜常用于葡萄糖传感器。 1.3 固定化酶载体的表面修饰 1.3.1 固定化酶载体表面修饰原则 载体表面必须要有能够被活化或进行化学修饰的功能基团,在不损害 载体骨架结构的条件下,此类功能基团能与间隔臂或配位体以共价键结合。 欲使用的载体确定后,它的孔率和骨架结构也就确定了,此时,对载体的 活化和功能化就成为了首要考虑的问题11。色谱介质的活化为色谱配基的 偶联创造了必要的条件。环氧氯丙烷、1,4-二羟基正丁烷双缩水甘油醚、羰 基二亚胺、二乙烯基亚砜等活化试剂被用于色谱介质的活化,以获得高密 度、稳定的活化基团12。这为进一步在微球上结
18、合各种不同官能团或直接 吸附生物分子提供了可能。 广西大学本科毕业论文 琼脂糖磁性微球活化条件研究 - 4 - 载体表面修饰引入的一般为氨基、环氧基、羟基、氯甲基、酰肼基等8。 活化方法的选取应遵循以下几点原则: (1)活化方法应能防止结合到载体上配基的脱落; (2)活化方法应避免产生非特异性吸附; (3)活化后不改变载体的其他性质; (4)活化方法利于后续配基的快速有效的偶联; (5)活化简单易行,可重复性高13。 1.3.2 固定化酶载体表面修饰环氧基 环氧基是一种常用的活性基团。环氧基固定化酶的原理是:酶分子上 的氨基、羟基、巯基等亲核基团进攻环氧基,使环氧基开环,从而使酶分 子固定于含
19、有环氧基的载体材料上。环氧活性基不仅易与酶蛋白分子,进 行化学结合,形成牢固的化学键,而且环氧基团易于进行化学修饰之后, 再与酶分子共价结合,比如用乙二胺和环氧基修饰的载体反应,得到氨基 修饰的载体,再用戊二醛作交联剂固定化酶。与氨基相比,环氧基修饰的 载体直接固定化酶时反应条件温和(温度 25,pH7.0),载体不需要预活 化,非常适合工业化大批量生产固定化酶,而酶的活性在固定化过程中不 易被破坏,此外环氧基可与酶分子中的多种活性基团如氨基、巯基及酚羟 基、咪唑基等反应,在恰当条件下,酶与载体可发生多点键合,因此得到 的固定化酶稳定性好,不易从载体上脱落。得到环氧化磁性微球之后,为 进一步在
20、微球上结合各种不同官能团提供了可能,为微球在生化分离当中 的应用提供了实验载体和理论基础。 在磁性载体材料上引入环氧基不仅可进一步发挥环氧基固定化酶的各 种优点,而且使载体材料在磁场作用下更容易回收使用,同时可应用磁性 流动床技术使用固定化酶,具有更广泛的应用前景,但是目前在磁性载体 表面引入环氧基的方法还不是很多。以下列举的是经典的几种环氧基活化 方法13。 (l)溴化氰活化法:在碱性条件下溴化氰与多糖上的羟基反应,将氰酯 键与亚氨碳酸酯键合到基质上,然后偶联配基而制得亲和载体。溴化氰活 广西大学本科毕业论文 琼脂糖磁性微球活化条件研究 - 5 - 化法操作步骤简单,重现性好,偶联条件温和,
21、特别适用于偶联敏感性生 物大分子。但是溴化氰活化法形成的异脲键易产生特异性吸附,且偶联时 共价键不稳定,偶联配基容易脱落,此外,溴化氰活化法操作危险性大, 反应后的残余液需经处理才可排放。 (2)环氧氯丙烷活化法:目前应用最广泛的活化方法,环氧氯丙烷试剂 易得、偶联配基比较牢固,且价格比较便宜。该法操作简单易行,危险性 相对较小。采用环氧活化法所形成的共价键稳定,配基不易脱落,活化过 程中可以自动引入三个碳原子的间隔臂分子,且非特异性吸附小。环氧氯 丙烷活化法是有机取代反应的机理,该反应过程是双分子亲核取代反应, 当载体基质负离子游离进攻环氧氯丙烷时,环氧氯丙烷的 C-O 键断裂,此 时,载体
22、基质上的游离基上的 O 与环氧氯丙烷上的 C 重新形成 C-O 结合键。 环氧活化法需在碱性条件下反应,不适用于碱敏感物质。此外,该法活化 度低,载体载量小(只有溴化氰活化的几分之一),而且偶联同时容易发生开 环反应,其主要原因有: 环氧氯丙烷自身水解,活化反应为碱性条件下进行,碱液起到了催 化的作用,但碱性时环氧氯丙烷易水解。 环氧氯丙烷的溶解性低,微溶于水,因此水溶液中凝胶环氧化反应 程度低。 环氧基高温长时间与碱液接触会生成二醇,活化反应的产物因带有 环氧基,可以继续与介质上的羟基反应生成交联物,生成的交联产物有可 能再与活化产物上的环氧基团反应生成更进一步的交联产物14。 (3)对甲苯
23、磺酸氯活化法:主要用于活化含羟基基质,配基偶联过程中 不产生新的电荷。但活化反应需在无水丙酮中进行,配基偶联简便,有机 相或水相中均可进行反应。 (4)缩水甘油醚活化法:这种活化的凝胶其偶联配基密度虽然只有溴化 氰活化 75%,但其化学性质更稳定,配基很少脱落,分离效果好,此外此 法对琼脂糖凝胶有交联作用,凝胶的刚性更好。 (5)高碘酸盐活化法等。 各种活化方法各有利弊,有的活化时间短,有的毒性低,有的形成的 键稳定,可以根据不同的偶联对象和实验目的进行选择。众多学者亦对许 多载体材料的活化和环氧基化做出了研究。 广西大学本科毕业论文 琼脂糖磁性微球活化条件研究 - 6 - 史清洪等12研究发
24、现以二甲基亚矾为环氧氯丙烷活化溶剂可极大地提 高凝胶的活化度,活化密度高达 100mmol/mL 以上,二甲基亚矾很好的消 除了琼脂糖凝胶载体与环氧氯丙烷之间的界面现象,强化了活化反应。 伍学勤等15人采用羰基二咪唑(CDI) 活化琼脂糖树脂,并用其成功制 备亲和层析柱及固定化酶。 潘丹卓16等对琼脂糖凝胶微球活化度条件的考察发现,通过引入亲水 性有机试剂二甲基亚砜,提高了 Sepharose CL-6B 介质环氧基活化密度。 在 10%体积分数的环氧氯丙烷、0.8 mol/L 氢氧化钠及反应时间 2.5 h 的优化 条件下,环氧基活化密度可达 100mol/mL 以上。 沈维云17探索过几种
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