真核生物基因定位的基本方法和遗传图的制作.doc
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1、真核生物基因定位的基本方法和遗传图的制作图距(map distance)即指两个基因在染色体图上距离的数量单位,它是以重组值1%去掉%号表示基因在染色体上的一个距离单位,即某基因间的距离为一个图距单位(map unit, mu)。后人为了纪念现代遗传学的奠基人摩尔根,将图距单位称为厘摩(centimorgan, cM)。假设两基因a-b间的重组率为17%,即这两个基因相距17个图距单位(17cM) 。基因定位(gene mapping)是指将基因定位于某一特定的染色体上,以及测定基因在染色体上线性排列的顺序与距离。基因定位的目的是通过将基因定位到染色体的基因座上后,以帮助我们理解和开发生物性状
2、的遗传性质,特别是通过遗传连锁将一种性状的遗传与另一种性状或标记相联系,或者通过将表型差异与染色体结构的改变联系起来。这在商业上可用于改良动植物的性状、定位和克隆人类的疾病基因等。1两点测交(two-point testcross):两点测交是指每次只测定两个基因间的遗传距离,这是基因定位的最基本方法。(我仅重点介绍三点测交)2三点测交(three-point testcross):三点测交就是通过一次杂交和一次测交,同时确定三对等位基因(即三个基因位点)的排列顺序和它们之间的遗传距离,是基因定位的常用方法。用三点测交能测出双交换,因此更能准确地反映出连锁基因间的相对距离。同样,在做三点测交时
3、需要用这三个基因的杂合子(abc/+,或ab+/+c,或a+/+bc等)同这三个基因的隐性纯合子(abc/abc)测交。下面还是以玉米的上述三个基因为例来说明,假如用于三点测交的两个亲本为:+ + + / + + +和c sh wx / c sh wx,则F1代的基因型为:+ + + / c sh wx,然后F1与三隐性纯合体c sh wx / c sh wx测交,获得如下的结果。从上表可以看出,8种表型的实得籽粒数各不相等,且相差悬殊,说明它们是连锁的。下面我们先不考虑wx,只考虑C-Sh间的情况,这样就可以计算出C-Sh间的重组值:C-Sh = (98+107+39+19)/6033 =
4、4.36%。按照同样的方法可算出Sh-Wx和C-Wx间的交换值分别为:Sh-Wx = (672+662+39+19)/6033 = 23.07%和C-Wx = (98+107+672+662)/6033 = 25.51%。根据这三个数据我们可以将这三个基因作如下的排列:很明显,25.51 不等于14.36+23.07。刚才我们讲过,在两个基因之间如果发生双交换,从表型上是检测不出来的,也就是说双交换的结果等于不交换,现在我们再回到上表,其中(39+19)个个体分别在计算C-Sh和Sh-Wx之间各用了一次,说明有(39+19)的个体是发生了双交换,但是我们在计算C-Wx间的图距时,没有将这个双交
5、换值算进去,显然C-Wx间的图距被缩小了,因此我们必须对这一结果进行校正。我们先算双交换值:(39+19)/ 6033 = 0.96%。由于一次双交换实际上包含了二次单交换,所以在计算C-Wx间图距时,应加上2倍双交换值,即C-Wx = 25.51+20.96 = 27.43。这样,27.43就等于4.36+23.07了。所以在这里特别要注意:在有双交换发生的时候,计算图距时一定要加上2倍双交换值。从任何一个三点测交的结果中,我们可以发现,所得的F2后代的8种可能的表型中,最多的2种是亲组合,最少的2种的双交换产物,中间数量的4种是单交换的产物。根据这些规律,对于一个三点实验结果,在不计算重组
6、值的情况下,一眼就能正确判断这三个基因的排列次序,即用双交换类型与亲本类型相比较,改变位置了的基因就是处于中间位置的基因。在上面的例子中:只有当Sh位于中间的时候,同时发生两个单交换后,才可能产生+ sh +或c + wx的个体,所以这三个基因的顺序是c-sh-wx,这自然跟我们在计算重组值后所得的结论一致。要注意的是,与两点实验一样,用三点实验必需要用三杂合体,因为如果不是杂合体,我们就无法判断是否发生了交换。根据概率知识,我们知道对于两个独立事件,它们同时发生的概率等于各自概率的乘积。对同一染色体上的三个基因来说,发生双交换的概率应该是两个单交换概率的乘积,在上面的例子中,理论上双交换率应
7、为:23.07% *4.36% = 1.0%,可是它的实际双交换值只有0.96%,实际双交换值小于理论双交换值。在这里实际值与理论值相差不是很大,而在有些例子中,理论双交换值与实际双交换值相差很大,譬如说理论双交换值为0.90%,可实际只有0.15%。可见每发生一次单交换时,它的邻近基因间也发生一次交换的机会就会减少,这种现象称为干涉(interference)。干涉的程度通常用并发系数(coefficient of coincidence, c)来表示:并发系数(c) = (实际双交换值)/(理论双交换值)其中理论双交换值为两个单交换百分率的乘积。并发系数在0-1之间。如果并发系数=1,则说
8、明两个单交换之间没有干涉;如果并发系数=0,则说明发生了完全干涉,也就是说第一个交换的发生完全干涉了第二个交换的发生,即没有双交换。在上面的例子中,并发系数=0.96/1.0=0.96, 干扰=1-0.96=0.04。另外在微生物发生基因转变的时候,并发系数可以大于1,这表示存在负干涉(negative interference),即一次交换的发生使第二次发生交换的频率增加了。以上讲的干涉是就一个完整的染色体为单位来说的,也叫染色体干涉(chromosomal interference)。我们知道,在减数分裂的前期,二价体是由4条染色单体组成的,交换并不限于某二条非妹妹染色单体之间,因而存在1
9、-3、1-4、2-3、2-4各种不同形式的交换 (A,B,C,D),在2-3之间已发生了一次交换的基础上,再发生2-3二线双交换、1-3三线双交换、2-4三线双交换和1-4四线双交换的机会是均等的。如果在两条非姊妹染色单体之间的一次单交换会干涉其它非姊妹染色单体之间的交换,这叫做染色单体干涉(chromatid interference),一般说来第一次交换仅对于2-3二线双交换有干涉,对其他类型的双交换没有干涉。遗传学图(genetic map)又称基因连锁图(linkage map)或染色体图(chromosome map),是一种依据基因之间的交换值(或重组值),表示连锁基因在染色体上相
10、对位置的简单线性示意图。通过一系列的三点测交或二点测交,我们可以把一对同源染色体上各基因的次序及相对距离标定出来,从而构成一个基因的连锁群。所谓一个连锁群(linkage group)是指位于一对同源染色体上的所有基因群。通过大量的实验我们已经知道一个生物连锁群的数目是等于或少于染色体的对数。对于这一点很容易理解,因为基因位于染色体上,至于少于染色体数,那是因为有些连锁群还未被发现。图10-4是果蝇的遗传学图,我们看到4个连锁群正好与4对染色体数相符。基因在遗传学图上的位置叫座位(locus),一般以最先端的基因位置为0,如果发现有新基因在更先端的位置时,就把0点让给新基因,其余基因的位置亦作
11、相应的移动。在前面我们已经讨论,交换值介于0到50%,但在遗传学图上我们可以看到超过50图距单位的,这是因为在这两基因间发生了多次交换,但实际上这两基因间的重组值不会超过50%,所以由实验得到的重组值与图上的重组值不一定是一致的,因此要从图上知道基因间的重组值只限于邻近的基因座位间。我们在这里所讲的遗传学图的界标是一些表型性状,Botstein等于1980年了提出现代遗传连锁图的概念,主要是将这些单纯的表型多态性界标改变为DNA序列的多态性作为界标,如RFLP、VNTR、STR、SNP等。脉孢霉四分子及其遗传学分析 利用脉孢霉(Neurospora crassa)进行遗传学分析具有许多优点:个
12、体小,生长迅速,便于培养;具有象高等生物那样的染色体,研究结果可在遗传学上广泛应用;除无性繁殖外,还可进行有性繁殖,一次杂交可产生大量后代;其无性世代是单倍体,没有显隐性,基因型直接在表型上反映出来;一次只分析一个减数分裂的产物,而二倍体合子是两个不同减数分裂产生的配子相互结合的结果,只有通过测交实验才能分析减数分裂的结果,手续麻烦得多。脉孢霉也叫红色面包霉(Neurospora crassa),其生活史见上图。脉孢霉是一种丝状真菌,它在培养基上象网状一样伸展生长,其单倍体世代是由多细胞菌丝体(mycelium)和分生孢子(conidium)所构成,由分生孢子萌发形成新的菌丝,这是它的无性世代
13、。在一般情况下,它这样循环往复地进行无性繁殖,这时都是进行有丝分裂,因而都是单倍体。脉孢霉的有性过程是由两个不同的交配型(mating type)菌丝通过原生质的融合和异型核的结合而形成二倍体的合子。二倍体合子存在的时间很短,它们能迅速长成长形的子囊(ascus)。每个子囊中的核都进行两次减数分裂,产生出4个单倍体的细胞核,再经一次有丝分裂形成8个核,每个核被厚膜所包围形成子囊孢子(ascospores)。由此我们可以看出,每一个子囊中的8个子囊孢子是单一减数分裂的产物。子囊孢子在适宜的环境中萌发,通过连续的有丝分裂产生新的菌丝体。脉孢霉的合子在子囊内进行二次减数分裂所形成的4个子囊孢子叫四分
14、子(tetrad),对四分子进行的遗传分析就叫四分子分析(tetrad analysis)。由于脉孢霉的子囊很狭窄,以至分裂的纺锤体不能重叠,只能纵立于它的长轴之中,所以在子囊里面进行分裂的细胞核是严格按直线顺序排列的,因此,在交配中,等位基因通过减数分裂所产生的细胞就呈现有规律的排列-顺序四分子(ordered tetrad)。通过四分子分析,我们可以获得许多重要的对于遗传分析的直接资料,譬如我们可以取得分离规律的直接证据,可以检验到有无连锁和交换等。 如用产生红色菌丝的正常脉孢霉菌种与产生白色菌丝的变种交配,两个分生孢子的单核结合成为二倍体的合子,在子囊中进行减数分裂和有丝分裂,生成8个单
15、倍的子囊孢子,在子囊未破裂之前将各子囊中的子囊孢子按顺序一个个地在显微镜下用很细的针剥离出来,进行分别培养而获得每个孢子的菌丝,结果将会见到每个子囊中有四个孢子长出红色菌丝,另外四个孢子长出白色菌丝,成1:1的比例,这是由于等位基因在减数分裂时发生分离的结果,这样就更为直接地证明了分离规律。假设在同源染色体上有一对等位基因A和a,如果在着丝点和这对等位基因之间没有发生过交换,那么在第一次减数分裂时A和a就完全分开进入不同的两极,第二次减数分裂时,染色单体分开,进入四个孢子,进一步的有丝分裂形成8个子囊孢子,8个子囊孢子呈AAAAaaaa(或aaaaAAAA)的排列方式,在这种方式中,A和a基因
16、的分离发生在减数分裂的第一次分裂,我们将这种分离方式叫第一次分裂分离(first division segregation,MI)。当非姊妹染色单体在着丝粒和基因座(A, a)间发生交换时,在第一次减数分裂后,由于在这个过程中只有同源染色体的分离,因而等位基因A和a仍同时存在于同一核中,只有到减数分裂第二次分裂时,A和a才进入不同的核中,所以称这种情况为第二次分裂分离(second-division segregation,MII),由此得到的等位基因的排列模式AAaaAAaa(或它的镜像排列aaAAaaAA)称为MII模式(图10-9)。这种模式的特征是在一半的四分子产物中发生了重组,这种交
17、换型排列模式还有可能出现AAaaaaAA(或aaAAAAaa),这是由于纺锤体的随机趋向所致,A上a下和A下a上或A下a上和A上a下都是随机的,而且它们的频率也大致相当。我们知道染色体上两个基因座之间的距离愈远,则它们之间发生交换的频率愈高,因此当第二次分裂分离的子囊愈多,则说明有关基因和着丝粒的距离愈远。所以根据第二次分裂分离子囊的频数,就可以计算出某一基因和着丝粒间的距离,这距离称为着丝粒距离(locus-to-centromere distance)。这种以着丝粒作为一个座位,计算某一基因与着丝粒的距离(重组值),叫着丝粒作图(centromere mapping)。下面来看看如何进行着
18、丝粒作图。通过一个实例来说明,假设有两种不同接合型的脉孢霉菌株,一种是能合成赖氨酸的野生型菌株(记作+),该菌株成熟的子囊孢子呈黑色,另一种是赖氨酸缺陷型(记作-),这种菌株的子囊孢子成熟后呈灰色。将这两种菌株进行杂交(+-),根据黑色孢子和灰色孢子的排列次序,杂种子囊中减数分裂的产物共有6种子囊型,其计数的结果见表(表丢了,精神领会就行了。)表中1和2、3和4、5和6子囊中的子囊孢子的排列方式是互为镜影的,这说明减数分裂是一个交互过程。凡属第一次分裂分离的子囊,均是着丝粒和所研究的基因间末发生过交换的,所以称作非交换型,如子囊型1和2,其基因座的分离方式为2:2。子囊型3、4、5和6均属于第
19、二次分裂分离的子囊,它们在减数分裂后形成的子囊孢子的排列顺序是+_+_(或_+_+)(基因座的分离方式为1:1:1:1)以及+_ _+(或_+_)(基因座的分离方式为1:2:1)。由此可见,凡是第二次分裂分离的子囊,一定是在着丝粒与所研究的基因之间发个过交换的,故MII型也称作交换型。根据以上分析,合成赖氨酸的基因与着丝粒间的重组值为:即合成赖氨酸的基因与着丝粒间的图距为7.3cM。以上讲的是一对基因的四分子分析,下面我们来看看二对基因的四分子分析。在二对基因杂交时,如果只考虑性状的组合,而不考虑孢子排列的顺序,可以将子囊分为下列三种类型:1、亲二型(parental-ditype,PD):
20、2种基因型都跟亲代一样; 2、非亲二型(nonparental-type,NPD):2种基因型都跟亲代不一样,是重组型;3、四型(tetratype,T):4种基因型,2种跟亲代一样,2种跟亲代不一样。 通过四分子分析,可以帮助我们确定二对基因之间是否连锁。当二对基因位于不同的染色体上时,由图10-12可以看到,在没有交换时,亲二型(PD)和非亲二型(NPD)各占50%;在发生交换时产生四型(T),其中亲本类型和重组类型也都是各占50%。因此总的来说,当二对基因位于不同的染色体上时,重组类型占50%,亲本类型占50%,这符合自由组合规律。也就是说当亲二型的频率与非亲二型的频率相等时(PD=NP
21、D),我们可以说两个基因是自由组合的。当二对基因位于同一染色体上即这两对基因连锁时,产生亲二型和非亲二型四分子的频率是不一样的。如果在二个基因之间没有交换,将产生PD型子囊(图a);如果在二个基因之间发生一个单交换,将产生T型子囊(图b);如果在二基因之间发生二线双交换,由于没有重组子代的产生,仍为PD型子囊(图c);如果在二基因之间发生三线双交换,因涉及到四条染色体中的三条,则会有两种不同的方式,2-3,4(或1-3,4)三链双交换和3-1,2(或4-1,2)三链双交换,但都产生T型子囊(图d);如果在二基因之间发生四线双交换,将产生NPD型子囊(图e)。综上所述,亲二型(PD)是通过非交换
22、和二线双交换而产生的,非亲二型(NPD)仅仅通过四线双交换产生,而四线双交换只是四种可能的双交换之一(见图10-13c,d,e),非常之少。因此如果亲二型的频率远大于非亲二型的频率(即PDNPD),我们可以说两个基因是连锁的。一旦我们知道两个基因是连锁的,以及我们知道了每一种减数分裂四分子类型的相对数目,通过下述公式我们就可以算出两个基因间的距离: 其中:重组子数目 = /T + NPD,非重组子数目(即亲本型数目)= /T + PD。 细菌的遗传分析与基因定位由于细菌结构简单,世代周期短,通常20分钟一代,而且容易获得各种类型的突变型如合成代谢功能突变型、分解代谢功能突变型、抗性突变型等,所
23、以自20世纪40年代以来细菌已成为遗传学研究中最常用的实验材料。细菌不但可在液体培养基上生长,也能在琼脂固体培养基上生长。在固体培养基上,我们可以观察到由单个细胞长成的菌落,细菌的遗传分析通常是在这样的固体培养基上进行的。细菌属于原核生物(prokaryotes),没有明显的细胞核,不进行减数分裂,其基因的传递方式是非减数分裂式的。细菌的染色体是裸露的,它比较容易接受带有相同或不相同物种的基因或DNA片段的插入。细菌之间遗传物质的转移主要有以下三种方式:转化、接合和转导。转化(transformation)是指通过外源DNA进行的遗传物质的转移。转化可以分为自然转化(natural trans
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