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1、大连理工大学本科毕业设计(论文)脂肪干细胞部分去分化的实验研究Experimental Research on Partial Dedifferentiation of Human Adipose-Derived Stem Cells 学 院(系): 化工学院 专 业: 化学工程(英强) 学 生 姓 名: 姜 乔 学 号: 201048531 指 导 教 师: 李香琴 评 阅 教 师: 201048549 完 成 日 期: 2014.6.10 大连理工大学Dalian University of Technology脂肪干细胞部分去分化的实验研究摘 要干细胞,是一类尚未充分分化,具有自我复制能
2、力的多能细胞,自从被人们发现,就因为其有能力分化成各种组织器官而被人们高度重视。而脂肪,又是人体内含量较多的成分之一。近些年来,从脂肪中分离提取干细胞,并加以培养充分利用成为了生物与医学相联系的交叉领域,得到了越来越多人的重视。此次研究在充分了解脂肪干细胞的背景知识下,通过对脂肪干细胞的分离,体外培养和检测鉴定来进一步了解脂肪干细胞在分离与培养过程中的生物学特性,并验证了利用诱导脂肪干细胞来分化成各个器官的生物学优势。而后的检测鉴定,清晰得表明了脂肪干细胞在某种诱导条件存在下,具有较强的分化能力,能够在体外向骨,脂肪和软骨等方向分化。而为了再次证明脂肪干细胞的分化能力,本次研究设计了一实验即利
3、用质粒转染脂肪干细胞,通过观察其对某种特定基因的表达情况来检测脂肪干细胞是否通过重编程来分化成其他组织及细胞。为了完成这一实验,首先要利用质粒扩增技术来扩增pIRES2-EGFP-hOKSM质粒DNA。而后,利用这种质粒来转染脂肪干细胞。本次实验对pIRES2-EGFP-hOKSM质粒DNA的扩增比较成功,最后获得得浓度为1.1g/L。利用此种质粒转染之前分离提取并加之培养得脂肪干细胞。最后证明了脂肪干细胞向上皮样细胞的转化过程。关键词:脂肪干细胞;分化潜能;质粒;转染 I脂肪干细胞部分去分化的实验研究Experimental Research on Partial Dedifferentia
4、tion of Human Adipose-Derived Stem CellsAbstractStem cell is a kind of cell that is not fully differentiated. With the ability of self-replicating, it is a kind of multipotent cells. Since stem cell has the potential to differentiate into all kinds of tissues and organs, people pay much attention ev
5、er since it was publicized. Adipose, a composition largely existing in human body is bored by more and more modern people. So to separate stem cells from adipose in human body is now a popular subject in both biochemistry and medical science.The research is based on the fully understanding of the ba
6、ckground knowledge of adipose stem cells. Through the separation of adipose stem cells in vitro and detection and identification to learn more about the biological characteristics of adipose stem cells. To verify the use of induced adipose stem cells to differentiate advantage into the biology of va
7、rious organs. Then the detection and the identification, have clearly demonstrated induction of adipose stem cells in certain conditions in the presence of a strong differentiation ability to differentiate into bone, fat and cartilage in vitro. In order to prove that differentiation of fat stem cell
8、s again, this study designed a test that using plasmid transfection of adipose stem cells, by observing its expression of a particular gene to detect fat stem cells whether through reprogramming to differentiate into other tissues and cells. To accomplish this experiment, the first thing to do is to
9、 amplify the using plasmid pIRES2-EGFP-hOKSM DNA. Then, using this plasmid to transfect adipose stem cells. The experiments of amplification of pIRES2-EGFP-hOKSM plasmid DNA is rather successful to obtain a final concentration of 1.1g/L. Before the use of separation and extraction of such plasmid wa
10、s cultured and combined with fat stem cells. Finally, the experiment proved the transformation process of adipose stem cells to the epithelial cells. Key Words:adipose-derived stem cells;Differentiation potential;Plasmid;TransfectionII目 录摘 要IAbstractII1. 文献综述11.1 脂肪干细胞的生物学特性11.1.1 脂肪干细胞的来源11.1.2 脂肪干
11、细胞的分离21.1.3 脂肪干细胞的培养21.1.4 脂肪干细胞的鉴定31.1.5 脂肪干细胞的生物学优势31.2 重编程与部分重编程31.2.1 重编程的含义31.2.2 重编程的机制41.2.3 部分重编程的研究41.2.4 体细胞重编程的方法51.3 重编程技术发展的历史和现状61.3.1 体细胞核移植技术61.3.2 细胞融合技术71.3.3 诱导多能干细胞技术81.3.4 细胞重编程面临的障碍92. 脂肪干细胞分离培养及检测实验102.1 实验材料准备102.1.1 实验药品及试剂102.1.2 实验溶液和试剂的配置112.1.3 实验主要仪器及设备112.1.4 实验组织来源122
12、.2 实验方法122.2.1 脂肪干细胞的分离培养122.2.2 脂肪干细胞体外分离培养过程示意图142.2.3 细胞形态学的观察142.2.4 脂肪干细胞的多向分化潜能检测152.3 实验结果152.3.1 细胞形态观察152.3.2 脂肪干细胞的多向分化潜能163. 质粒扩增提取及其鉴定实验183.1 实验材料准备183.1.1 实验药品及试剂183.1.2 实验溶液和试剂的配置183.1.3 实验主要仪器及设备193.1.4 实验用大肠杆菌与质粒来源193.2 实验方法阐述193.2.1 pIRES2-EGFP-hOKSM质粒的扩增193.2.2 pIRES2-EGFP-hOKSM质粒的
13、鉴定203.2.3 pIRES2-EGFP-hOKSM质粒DNA的浓度和纯度鉴定213.3 实验结果展示213.3.1 pIRES2-EGFP-hOKSM质粒的扩增213.3.2 pIRES2-EGFP-hOKSM质粒的鉴定223.3.3 pIRES2-EGFP-hOKSM质粒DNA的浓度和纯度鉴定224. 质粒转染脂肪干细胞的实验234.1 实验材料准备234.1.1 实验药品及试剂234.1.2 实验溶液和试剂的配置234.1.3 实验主要仪器及设备234.2 实验方法阐述244.2.1 Lipofectamine 2000 脂质体包埋pIRES2-EGFP-hOKSM质粒转染脂肪干细胞2
14、44.3 实验结果展示244.3.1 质粒转染脂肪干细胞的过程总述244.3.2 OKSM质粒转染hADSCs254.3.3 转染细胞的多能性检测26结 论27参 考 文 献28致 谢311. 文献综述脂肪干细胞(adipose-derived stem cells ADSCs)是从脂肪组织中分离提取获得的拥有较强分化潜能的一种干细胞。2001年Zuk等人通过脂肪抽吸术,在吸出的人体脂肪悬液中第一次分离获得了脂肪干细胞,发现之时就被证明具有向脂肪、软骨、成骨、成肌、血管内皮、肝、胰、神经细胞系等多向分化的潜能。加之其能够在体外稳定增殖、衰亡率低、易于取材适宜大规模培养、对机体损伤小等等众多特点
15、,脂肪干细胞逐步成为新的研究热点。针对这些脂肪干细胞的特点,将其应用在应用重编程或部分重编程而诱导成多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)或中间体的细胞来源上,不仅避免了细胞获得性免疫原性的问题,也不涉及到伦理和法律问题,减少肿瘤形成的危险,是一种非常有潜力的研究方向。本文主要研究通过重编程和部分重编程诱导脂肪干细胞转化成具有更强分化能力的多能干细胞(iPSCs)或者其中间体细胞的方法,针对这一实验进行相关技术的讨论。1.1 脂肪干细胞的生物学特性1.1.1 脂肪干细胞的来源2001年,Zuk等人从人类脂肪组织中分离获得了成纤维样细胞群,被称为脂
16、肪干细胞(ADSCs)并发现它可以自我更新,有向成骨,成肌,脂肪等方向的分化能力。到目前为止,人、猪、兔子和鼠类等物种的脂肪组织中都可以提取出脂肪干细胞。脂肪组织中所含有的干细胞数量不会随着年龄的增加而减少,这也是脂肪干细胞的一大优良特性。研究发现,脂肪干细胞和骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有很多相似的生物学特性,提取同一人体内的两种细胞进行对照观察发现在细胞形态、细胞衰老性、生长动力学、表面标志蛋白、多向分化潜能和外源基因的导入效率等方面没有明显区别。造成这种现象的原因可能是两种细胞的来源比较相似。脂肪干细胞与骨髓间充质干细胞在不同的培养条件下可以分化成不同的中胚层来源的组织细胞,并且都含
17、有支持成熟组织的基质成分。这两种细胞的相对区别体现在培养方面的具体要求上,脂肪干细胞不像骨髓间充质干细胞对培养基要求比较高,需要的胎牛血清来源不受限制,血清的批号也基本没有影响。而近年来,由于肥胖人群的增加,主动要求抽吸脂肪的人越来越多,所以大量获得脂肪组织变得相对容易,而且抽取脂肪的部位也可以再生脂肪,这些都使得脂肪干细胞的大量获取变得可能。1.1.2 脂肪干细胞的分离目前最常用的分离方法是利用脂肪抽吸术,将得到的脂肪组织,用D-Hanks液反复冲洗,剪碎。用预温的0.1% IV型胶原酶37,消化一小时。100目筛网过滤除去未消化的组织。将滤出液置入离心管中, 设置离心机速度为1000r /
18、min, 室温离心10分钟, 弃上层清液。用D-Hanks液重悬充分洗涤,重复2 3次,以除去IV型胶原酶,再次离心,弃去上层清液, 并使用移液管进行反复吹打,使之最后能够成为单细胞悬液从而来计数,以12 106/mL的接种密度接种于DMEM _LG+10% FBS培养液中, 将其放置在恒温37摄氏度 , 5%CO2 的饱和湿热培养箱培养。接下来2天,每天换液一次,并用PBS 轻轻洗涤,弃去组织块和未贴壁的细胞,以后每3天换液一次。当细胞达80% 90%融合时,配置0.25%胰酶(含0. 02%的EDTA)对其进行常规消化从而进行传代培养。Brian报道,利用这样的方法,每200ml脂肪组织可
19、最终得到大约106个脂肪干细胞,并且可以在连续培养1315代之后继续保持稳定的倍增率,衰老和死亡细胞所占比例很少。随着技术的发展,还有一些新的分离方法出现。比如说从膨胀液种分离脂肪间充质干细胞等。1.1.3 脂肪干细胞的培养脂肪组织中的脂肪干细胞含量相对来说是很低的,所以如果我们要利用脂肪干细胞来进行某些实验研究的话,进行体外分离培养增殖就成为了必定要采用的方法。采用的方法常见为在抽取脂肪组织,并且进行上述分离过程之后,将细胞重悬于MEM培养液种,添加至培养皿,37,CO2孵箱种培养24小时,除掉还未贴壁的细胞还有一些其他残渣,并且需要添加新鲜的培养液给那些已经贴壁的细胞。等到细胞培养以至于达
20、到80%融合的程度时,用胰酶或EDTA消化之后按11的比例进行传代培养。脂肪干细胞在体外培养的条件下拥有着非常强的贴壁能力,已经贴壁的细胞显现为梭形并且类似于成纤维细胞样的形态,总体以平行样式排列,胞质和核仁都非常丰富。在培养脂肪间充质干细胞(脂肪干细胞)的整个过程中,选择使用培养基是一个仁者见仁智者见智的问题,主要有低糖培养基(L-DMEM)、基础培养基(-EM)、混合培养基(DF12)及高糖培养基(H-MEM)等,但最终的目的都万变不离其宗,就要达到在培养过程中保持细胞增殖活性并且要尽可能得保证脂肪干细胞的多向分化潜能。而实验对比表明,低糖培养基更适合培养脂肪干细胞,更有利于维持脂肪干细胞
21、的多向分化潜能。同时,实验证明,保证25%左右的血清浓度可能使脂肪间充质干细胞向脂肪细胞分化,而在低氧低血清的条件下培养细胞,可能加快脂肪间充质干细胞的凋亡速度。1.1.4 脂肪干细胞的鉴定Zuk认为脂肪干细胞由多种异源性细胞构成,包括内皮细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞和前体脂肪细胞等等。通过学者利用单克隆抗体鉴定脂肪干细胞成分,实验结果显示脂肪干细胞主要由成纤维细胞和间叶组织的细胞组成,伴有少量的内皮细胞和平滑肌细胞。确认和识别脂肪干细胞的表面蛋白和其基因对于鉴定来说是必要的。通过Gronthos等人的实验,我们可以知道脂肪干细胞表面标志蛋白的基本种类,并且能确定,经过诱导培养后的脂肪干细胞表
22、面蛋白的表达与未分化之前大致相同。综上所述,鉴定脂肪干细胞最好的方法就是对其进行多系定向诱导,并且进行相应的检测,来确定诱导成功。而免疫组化染色和流式细胞仪检测等免疫表型结果对确认脂肪干细胞有辅助作用。1.1.5 脂肪干细胞的生物学优势相比于其他干细胞,脂肪干细胞(ADSCs)有着很多优势:(1)取材方便,对供区影响小,并发症少(2)分离培养简单,容易获得,增值能力强,细胞移植不需在体外长期培养扩增(3)来源相对充足(4)在诱导因子作用下具有定向分化能力(5)组织相容性好,能适应体内环境, 保持良好的生物学特性且不引起免疫排斥反应等。由于这些优势,选择脂肪干细胞作为间充质干细胞的来源是非常可行
23、的。1.2 重编程与部分重编程1.2.1 重编程的含义细胞重编程(Cell reprogramming)主要指体细胞重编程,是将已分化的细胞通过逆向分化,使其重新获得多能性或全能性的过程(Yamanaka and Blau, 2010) 。在生命发育过程中,随着细胞的不断分裂和分化,最终形成完整的个体,而体内的细胞也在发育过程中走上了不同的命运。但是,看似完全不同的各类体细胞的细胞核却都拥有完整的遗传物质,而细胞重编程正是建立在细胞核全能性的基础之上。多年以来,人们一直在研究细胞的重编程及细胞核的潜在全能性。从早期的多莉羊,到2006年日本京都大学Yamanaka教授在Cell上发表里程碑式文
24、章,阐述其用四个因子(Oct3/4、Sox2、Klf4和c-Myc)将小鼠成纤维细胞逆转为类似多能干细胞的实验结果,开创诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)时代。人们对细胞核全能性的追求一直强烈。而到目前为止,包括体细胞核移植、细胞融合、细胞提取物诱导、化学诱导以及分子调控诱导等方法,均被证明可以使细胞进行重编程。通过重编程技术,人们可以在同一个体身上将较易获得的细胞类型转变成某一特定的细胞类型,而且可以有效得避免异体移植会产生的免疫排斥反应。这种技术如果发展成熟,将对治疗人类疾病起到非常显著的作用。1.2.2 重编程的机制细胞的重编程是一
25、个极其复杂的过程,其机制的研究对诱导性多能干细胞细胞的制备、制备效率的提高、安全性的评估、临床应用都有着非常重要的作用。目前关于重编程的机制普遍认为,体细胞通过导入外源性的转录因子可以激活内源性的Oct4与Sox2的表达,一旦内源性的Oct4与Sox2得以表达后,便会迅速在细胞内形成一个自我调节的网络用以维持诱导性多能干细胞的多能性,此后即不再需要外源性基因的诱导与维持。对于在重编程中每种转录因子的具体作用、不同转录因子的组合是否通过相似的机制等问题人们还知之甚少,还有待于进一步的研究。与此同时,经过重编程形成的iPSCs的研究和应用同样面临很多困难。在某些诱导的培养条件下, iPSCs甲基化
26、、基因突变、拷贝数的变异概率增加,致瘤性甚至高于胚胎干细胞,都使其应用安全性受到很大的质疑。其次,和胚胎干细胞研究一样,如何高效地将诱导性多能干细胞诱导分化为特定亚型的细胞仍然是一个难点。1.2.3 部分重编程的研究强制表达几个转录因子可以使体细胞重编程为iPSCs。通过对正在发生重编程的人成纤维细胞进行一系列的实时成像分析,Chan等鉴定出了几个独特的细胞集落类型,它们在形态上与ES细胞相似,但是在分子表型和分化潜能上与ES细胞又有所不同。通过对这些细胞的多潜能marker、OCT4和NANOG基因启动子甲基化状态、以及分化形成畸胎瘤进行分析,确定了这些细胞集落类型中只有一个是真正的iPS细
27、胞,其余的都是重编程的中间体(即部分重编程的iPS细胞)。TRA-1-60、DNMT3B和REX1三个基因的原病毒沉默和表达可以被用于区分这些细胞是否处于已完全重编程的状态,而碱性磷酸酶、SSEA-4、GDF3和NANOG还不足以作为细胞已发生完全重编程的marker。研究结果还表明,使用化学成分确定的培养基培养细胞有利于形成完全重编程的状态,而不会形成部分重编程的细胞集落。研究结果确定了完全重编程状态的细胞marker,彰显出对iPS细胞进行准确定性和标准化这一需求的重要性。由麻省总医院、哈佛干细胞研究所的研究人员领导的一个国际研究小组,在新研究中绘制出了体细胞重编程为诱导多能干细胞的分子路
28、线图。在这篇文章中,研究人员通过全基因组分析检测了预备转变为iPS细胞的中间前体细胞。研究人员证实诱导多能性过程引起了两次转录波,第一波是由c-Myc/Klf4驱动,第二波是由Oct4/Sox2/Klf4驱动。难以发生重编程的细胞激活了第一波,但却无法启动第二转录波,提高4个因子的表达则可以解决这一问题。此外,研究人员发现在第一波后逐渐形成了一些双价基因(Bivalent genes),而在第二波后细胞获得稳定的多能性之时细胞才发生DNA甲基化改变。通过这一综合性的分析,研究人员还确定了在重编程过程中充当路障的基因,以及细胞进一步富集从而使之更易于形成iPSCs的表面标记物。细胞的部分重编程,
29、在iPS中间体阶段直接转化为另一种细胞,避免了细胞获得性免疫原性的问题,也不涉及到伦理和法律问题,减少肿瘤形成的危险。最近的一系列研究进展不仅为重编程的分子机制研究提供了新视角,也为加速重编程细胞的应用带来了希望。1.2.4 体细胞重编程的方法至今为止,体细胞重编程的主要方式可以分为三种,即体细胞核移植(somatic cell nuclear transfer, SCNT),细胞融合(cell fusion)和诱导多能干细胞(induce reprogramed stem cell, iPS)技术。体细胞核移植起步较早,最初主要在两栖类中进行相关研究。因为两栖类动物的卵母细胞大,较易获取,核
30、移植的过程相对容易操作。直至上个世纪 90 年代,“多莉”绵羊的出生,使体细胞克隆技术首次在高等哺乳动物中获得成功。此后,体细胞克隆技术迅猛发展,先后出生了体细胞克隆牛、小鼠、山羊、猪等克隆动物。当前,体细胞克隆技术已成为现代生物技术领域中最为重要的技术之一,并被广泛的运用于转基因动物的生产,在生物学,医学和畜牧学生产上均具有重要的意义。同时,体细胞核移植技术的成功,完善了生物学的一些重要理论,证明了动物体细胞细胞核遗传物质的一致性和全能性,可以通过卵母细胞对其进行重编程,获得与受精卵相同的发育潜能。细胞融合是将已分化的体细胞与具有多能性的干细胞或者受精卵进行融合,使得已分化的体细胞回复多能性
31、的一种技术,从另一方面证明了分化细胞的可塑性。在细胞融合的研究中,相互融合的两个细胞,一般都是具有多能性的细胞起主导作用,对分化的细胞进行重编程,使其回复多能性。诱导多能干细胞技术是近年来才发展起来的一种由特定转录因子和培养条件介导完成的细胞重编程技术。通过在分化的体细胞中导入特定的转录因子,并使用特定的培养条件进行诱导和筛选,最终使得分化的体细胞重编程为多能性干细胞。该技术最先于2006年在小鼠成纤维细胞上研究成功,并在之后的数年里迅速发展,目前已建立了相对比较完善的诱导重编程的操作程序。相信用不了多久,iPS技术就将会被应用于临床医学,更好的为人类健康服务。1.3 重编程技术发展的历史和现
32、状1.3.1 体细胞核移植技术20 世纪初,科学家在研究低等动物的胚胎发育时发现,低等动物胚胎的各分裂球之间遵循调整型发育的模式,相互之间能够进行互补,且最初的单个卵裂球能够发育成整个个体。1952 年,Briggs 和 King 等将已发育至桑椹胚的蛙胚细胞核注入到去核的蛙卵中,构建形成的核移植重构胚最终发育出了完整的蝌蚪。这是世界上首次细胞核移植试验,并获得了成功,使细胞核移植由理论变成了现实。1997 年,“多莉”羊的诞生,实现了体细胞克隆在高等哺乳动物上的成功,证明了体细胞细胞核的全能性,同时也证实了卵母细胞对体细胞的重编程作用。之后各常见物种的体细胞核移植动物先后克隆成功。但是,由于
33、多数成体组织中都含有多种细胞类型,即成体干细胞,祖细胞和终末分化的细胞,由于没有特定的标记基因来确切证明供核细胞的终末分化状态,因此,在“多莉”羊出生后的最初几年里,仍然有研究者怀疑终末分化细胞的重编程能力。之后,以成熟的淋巴细胞和神经细胞为供核细胞的克隆小鼠的出生,最终证实了终末分化的体细胞,其细胞核的全能性同样不受影响。但是通过核移植技术生产克隆动物的效率很低,大部分重构胚胎在附植之后出现死亡和流产,仅有很少的胎儿能够活着出生,而且出生后常伴有很多严重的疾病,例如胎儿体积过大和早老症等。早期在两栖类上的核移植研究发现,供核细胞的年龄与出生的克隆动物的寿命之间呈负相关,即核移植出生的个体继承
34、了其供核细胞原先的寿命。因此,供核细胞的分化状态是否会对核移植效率产生影响一直是大家所关注的问题。核移植效率一般通过重构胚胎的囊胚率,胎儿的妊娠率和克隆动物的出生率来衡量。重构胚胎的囊胚率受核移植过程的试验条件影响较大,如供核细胞所处的周期阶段和细胞的生理状态等。因此,囊胚率对于核移植的效率并没有很高的参考价值。例如核移植过程中,供核细胞需要与处在分裂中期的卵母细胞进行同步化,而供核细胞一般处于细胞周期的不同阶段,所以得到的核移植重构胚胎的分裂效率也各不相同,因此,囊胚率的高低并不能作为衡量重编程质量的指标。尽管如此,只要重构胚胎能够发育至囊胚阶段,就有可能产下克隆动物或者从胚胎中分离出ES
35、细胞。所以,在重构胚分裂之后统计囊胚发育率,乃至个体出生率或 ntESCs 的分离效率,来衡量核移植效率的高低显得更为科学。核移植胚胎干细胞是核移植重编程的产物之一,也是衡量体细胞核移植效率的重要指标,ntECSs的多能性状态直接反映了核移植重编程的程度。目前主要通过有三项检测指标来确定ntESCs的多能性。首先,ntES细胞要求在体外能够无限增殖,且将其注射到免疫缺陷鼠中能够产生三胚层的畸胎瘤;其次,通过四倍体囊胚补偿技术,检测所得的ntES细胞是否能够产下完全由该细胞发育而来的正常后代;第三,分析ntES细胞的基因表达谱系,其全基因表达水平要求与体外受精胚胎而来的ES细胞没有明显的差别。此
36、外,人ntESCs的分离培养显得尤为重要,由于人的胚胎较难获取,而且涉及伦理道德问题,因此,如果能够得到人的核移植囊胚,并从其中分离得到ntES细胞,对于再生医学和基因治疗具有极其重要的意义,还可以解决ES细胞在临床应用上的免疫排斥问题。但是人体细胞核移植受到伦理道德的约束,且人卵母细胞的获取较为困难,最初的研究并没有得到核移植囊胚。后来有研究者将人的供核细胞注射到兔子的卵母细胞中构建重构胚胎,并发育到囊胚,但没能从中分离得到ntES细胞系。这可能是由于人和兔子物种间的核质不相容所引起,特别是兔子的线粒体与人的细胞核不能相容,这一现象也曾在不同物种之间的细胞融合时所发现。在早期的猴子核移植研究
37、中发现,灵长类核移植的主要困难是纺锤体的异常。但是在后来改进的核移植程序中得到了解决。此外,胚胎细胞核移植猴子的成功说明灵长类的克隆是可行的。1.3.2 细胞融合技术细胞融合是研究细胞可塑性的一个较为经典的实验,将具有不同多能性状态的细胞在体外进行融合,分化程度较高的细胞将会受到另一个多能性细胞的诱导,使分化细胞也回复到多能性的状态。早在1976年,Miller和Ruddle发现,将多能性的畸胎瘤(EC)细胞同原代胸腺细胞融合后,得到的多能性杂交细胞几乎具有畸胎瘤细胞的所有特性,并能诱发形成肿瘤。之后发现,将小鼠的体细胞与小鼠的胚胎生殖细胞,ES细胞等多能细胞融合之后,得到的杂交细胞同样具有后
38、者的多能性状态。在人ES细胞的研究中同样如此。但是以上结果仍然无法确认体细胞在融合过程中是被多能性细胞重编程了或是发生了基因表达的沉默。分子水平的检测发现淋巴细胞与ES细胞融合后的杂交细胞中来源于前者的X染色体得到了重新激活,与多能性相关的基因也被去甲基化,并成功得到激活。畸胎瘤试验进一步证明多能干细胞与体细胞融合形成的杂交细胞在体内能成功分化为三胚层组织。以上结果显示,体细胞的染色体组在融合过程经历了表观遗传水平的重编程。杂交细胞能够在体内形成分化程度较高的肿瘤,说明融合前的胸腺细胞在融合时已被EC细胞重编程成为多能性细胞。此外,对于EC细胞与分化细胞的融合试验,也有研究者持相反意见,认为杂
39、交细胞产生的肿瘤出现多向分化现象,是由于EC细胞中抑制分化的基因在融合过程中被稀释所致,而不是因为体细胞基因组的重编程。但至今为止,仍没有确切的证据证实体细胞的细胞核在融合过程完成重编程,重新获得了多能性,并且在取出EC细胞的基因组后仍能够完成体内外的多向分化。细胞融合重编程的研究主要面临两个问题,即在融合重编程过程中多能性细胞的胞质与胞核哪个起主要作用,以及重编程的过程是否需要DNA的复制。对此,研究者将多能性细胞的胞质与胞核中的物质分别与神经细胞进行融合,结果显示,与胞核部分相融合的神经细胞,其细胞内的Oct4-GFP报告载体表达了荧光,而与ES细胞胞质部分相融合的杂交细胞中没有显示绿色荧
40、光。由此可见,多能性细胞核内的转录因子对体细胞融合后发生的重编程起着关键的作用。对于DNA复制在细胞融合重编程中的作用还了解较少。对于单个ES细胞与体细胞的融合实验结果认为重编程过程必须进行细胞复制,但是体细胞核移植研究显示基因组DNA的去甲基化激活可能并不依赖于细胞或DNA的复制。两者之间研究结果的差异可能是由于细胞类型的差别(多能细胞与卵母细胞之间的差别)或者技术手段差异所引起的。不依赖体细胞核移植技术进行细胞重编程,这是一条理想的获取多能性细胞的途径。但是,通过细胞融合技术得到的多能性细胞,很难再将其中ES细胞的细胞核从杂交细胞中取出来,因此,通过融合的方法得到的杂交细胞要应用于移植和治
41、疗仍有较大的困难。1.3.3 诱导多能干细胞技术诱导多能干细胞技术是在体细胞核移植和细胞融合技术的基础之上发展起来的一种新的细胞重编程方法。体细胞核移植和细胞融合所产生的重编程效果使研究者认识到卵母细胞或者 ES 细胞等多能性细胞中存在着某些能够促进体细胞或分化细胞逆向分化,重编程为多能干细胞的物质。因此,通过对多能干细胞中特异表达的一些基因进行筛选,最后发现 4 个对细胞重编程最为重要的转录因子,即是 iPS 诱导时最为常用的Oct4/Sox2/Klf4/c-Myc(OSKM)四个转录因子。而另一研究小组采用类似的方法发现 Oct4/Sox2/Nanog/Line28(OSNL),四个因子同
42、样可以诱导人的成纤维细胞转化为多能干细胞,但是后来的研究证明 OSNL 四个因子的诱导效率较 OSKM 要明显低得多。iPS 细胞重编程的机理,是通过外源因子导入受体细胞之后,在细胞内进行高效的表达,从而改变受体细胞的基因表达网络,使细胞的基因表达处于活化状态,再结合特定的细胞培养条件,从而使得细胞向特定的方向进行转变。例如,为了得到 ES 细胞样的多能性干细胞,在外源因子导入之后采用 ES 细胞的培养条件进行诱导培养,从而使细胞逆向分化为 ES 细胞样的多能干细胞,达到最后重编程的效果。这一猜想在后续的相关实验中被陆续证实,如采用心肌细胞的培养条件,受体细胞就会最终向心细胞样的细胞进行分化;
43、如采用神经细胞的培养液,那么细胞最后就会转化为神经样细胞。虽然如此,诱导不同细胞向另一种细胞转化时所需的外源因子会有所差别,这可能与不同细胞之间的基因表达谱系差异有关。1.3.4 细胞重编程面临的障碍细胞重编程是基于 Oct4、Sox2、Klf4 和 c-Myc 过表达的一种多能性状态,至少一到两个星期后,第一批重编程细胞在培养皿中出现。这一过程的一个重要特点是,只有少数的最初表达重编程因子的体细胞在这段时间内最终转变成多能状态。事实上,有实验将单个前体 B 细胞单独铺于培养孔中,通过对这些重编程的克隆细胞计数发现,在2周内,只有3-5%的培养孔中的细胞重编程成功,而且即使这些重编程成功的培养
44、孔中,只有很少一部分子代细胞发生重编程。尽管大多数细胞表达所有的重编程因子,例如通过采用多顺反子编码全部四个因子的载体,或是采用二次重编程系统来控制转基因表达,但是最终获得重编程的克隆数相对于培养皿中的细胞仍然很少。有人设想,只有非建系定向细胞或是成体干细胞适合重编程,然而基于终末分化细胞,如胰岛细胞或末梢血细胞系,最终产生 iPS 细胞,使这种假设来解释效率低也被否定。同时,上述单克隆细胞重编程实验表明,几乎所有供体前体 B 细胞都可能产生重编程,因为在培养 18周后,超过 90%的培养孔中至少有几个细胞的多能性标记呈阳性,并且进一步的实验模型也反对只有一部分细胞能够重编程的观点。然而,关于
45、细胞的分化程度是否影响效率和动力学进程的争论还在继续。最初,由于受体细胞中插入病毒重编程因子编码的 DNA 导致插入突变也被怀疑,但是,非整合重编程的研究,病毒插入位点的映射,以及“重编程”小鼠模型,推翻了这种观点。总之,这些发现说明了自身重编程因子的表达不足以使细胞过渡到多能性状态,还需要克服阻止重编程的外源屏障。2. 脂肪干细胞分离培养及检测实验2.1 实验材料准备2.1.1 实验药品及试剂表2.1所示为本次实验所需要的药品和试剂表2.1 实验药品及试剂名称生产厂家KCl辽宁省医药经贸试剂厂KH2PO4天津市博迪化工有限公司Na2HPO412H2O天津市大茂化学试剂厂NaCl天津市大茂化学
46、试剂厂NaHCO3辽宁省医药经贸试剂厂无水乙醇天津市福晨化学试剂厂高糖DMEM培养基SIGMA 美国胎牛血清FBSGIBCO 美国胰蛋白酶GIBCO 美国II型胶原酶GIBCO 美国青霉素钠大连美罗药厂硫酸链霉素大连美罗药厂乙二胺四乙酸钠(EDTA)SOLARBIO 美国地塞米松SIGMA 美国-甘油磷酸钠SIGMA 美国胰岛素SIGMA 美国IBMXSIGMA 美国转铁蛋白SIGMA 美国吲哚美辛SIGMA 美国亚油酸SIGMA 美国维生素D3SIGMA 美国抗坏血酸SIGMA 美国TGF-1SIGMA 美国IGF-1甲苯胺蓝油红OSIGMA 美国SIGMA 美国SIGMA 美国2.1.2
47、实验溶液和试剂的配置(1) DMEM储备液:将高糖DMEM(HDMEM)粉末溶于1 L实验用超纯水(MilliQ水)后搅拌均匀,加入约2.0 g NaHCO3 ,使溶液的pH为7.2后搅拌均匀,之后进行过滤以及高压灭菌过程,完成后置于4 恒温条件下保存备用。(2) PBS缓冲盐溶液:称量KCl 0.1 g,KH2PO4 0.1 g,Na2HPO412H2O 1.445 g,NaCl 4.0 g,加入500 mL 实验用超纯水(MilliQ水)。充分溶解后进行高压灭菌过程,完成后置于4 恒温条件下保存备用。(3) 0.25% 胰蛋白酶溶液:溶解250 mg胰蛋白酶粉末至100 mL PBS缓冲盐溶液中,保持4 恒温放置一夜,之后过滤并灭菌,完成后置于-20 恒温条件下保存备用。(4) 0.1% I型胶原酶溶液:溶解100 mg胶原酶粉末至100 mL PBS缓冲盐溶液中,保持4 恒温放置一夜,之后过滤并灭菌,完成后置于-20 恒温条件下保存备用。(5) 油红O染色剂:称取预先研磨成粉的0.5 g油红O干粉,加入少量异丙醇进行溶解,溶
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