芽胞杆菌种类脂肪酸鉴定与分子鉴定方法的比较.doc
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1、期刊文献 目 录 芽胞杆菌种类脂肪酸鉴定与分子鉴定方法的比较1 福建茶园土壤菊酯类农药调查.13 柑橘木虱成虫过冷却点及结冰点的测定(1 月份)19 不同致病性青枯雷尔氏菌发酵液紫外扫描.23 短短芽孢杆菌 FJAT-0809-GLX 的基因预测及基因注释28 酶解后 BT、BTA 与小菜蛾 BBMVs 的相互作用的研究.34 漳州香蕉枯萎病株体内细胞壁降解酶的比较.40 期刊文献 芽胞杆菌种类脂肪酸鉴定与分子鉴定方法 的比较 刘国红刘国红 1,2,林营志 ,林营志 1, 刘波 刘波 1 (1 福建省农业科学院农业生物资源研究所,福建省农业科学院农业生物资源研究所,350003;2 福建农林大
2、学福建农林大学, 350002) 摘要:摘要:芽胞杆菌在自然界中分布广泛,因此芽胞杆菌也具有悠久的研究历史,但是其分类地位一直处于变化之中。 为了寻找一种简单快速的分类手段,本文基于 ITS 序列和脂肪酸鉴定方法对从土壤中分离得到的 16 株芽胞杆菌进 行分类研究,与分子鉴定结果相比,脂肪酸种的鉴定准确率可达到 99%以上。通过生物软件 SPSS 和 Mega 分别 对 16 株菌进行聚类分析,结果表明脂肪酸比 ITS 更适合于芽胞杆菌的分类研究,本根据脂肪酸成分可以将 16 株芽 胞杆菌准确的聚在一起,而 ITS 则不能。芽胞杆菌特征性脂肪酸为 15:0 ANTEISO 和 15:0 ISO
3、,但不同种芽胞杆菌 的此类脂肪酸含量不同。本文选取芽胞杆菌三大类菌群主要特征性脂肪酸的含量比例(15:0ISO/15:0 ANTEISO) 进行了分析。其中比较特殊的为蜡状芽胞杆菌类群,蜡状芽胞杆菌主要脂肪酸为 15:0ISO,其次为 13:0ISO,而 15:0 ANTEISO 的含量很低非主要类型,15:0ISO/15:0 ANTEISO 的比值约为 5.6-7.9。简单芽胞杆菌群主要脂肪酸 为 15:0 ANTEISO 和 15:0ISO, 15:0ISO/15:0 ANTEISO 比值约为 1/6 左右。巨大芽胞杆菌类群主要脂肪酸 15:0ISO 和 15:0 ANTEISO 含量相近
4、,其余脂肪酸远远低于这两种主要脂肪酸。巨大芽胞杆菌的 15:0ISO/15:0 ANTEISO 的比值为约 4/5-5/4,菌株 4500 为短小芽胞杆菌,其 15:0ISO/15:0 ANTEISO 比值约为 2。短小芽胞杆 菌和巨大芽胞杆菌脂归为一类是因为其脂肪酸类型相近,但含量并不同。枯草芽胞杆菌群主要脂肪酸 15:0ISO 的含 量小于 15:0 ANTEISO,15:0ISO/15:0 ANTEISO 的比值为 1/3-2/3。综上所述,根据以上所述,芽胞杆菌主要脂肪 酸含量和类型可以快速地初步判断未知菌株属于哪个类群,表明脂肪酸鉴定可以成为一种快速、有效、简单的芽胞 杆菌分类鉴定方
5、法。 关键词:芽胞杆菌;脂肪酸类型;关键词:芽胞杆菌;脂肪酸类型;ITS 序列;分类序列;分类 Comparison of Bacillus species identification based on ITS and fatty acid analysis Guohong Liu1,2, Yingzhi Lin1, Bo Liu1 (1Fujian Academy of Agricultural Sciences, 35003; 2 Fujian Agriculture and Forestry University, 350002) Abstract: Bacillus species
6、are widely distributed in nature. Although the study of genus Bacillus has a long history, its taxonomic status has been in changes. In order to find out a simple and rapid means for identification, 16 strains of Bacillus species isolated from soil were studied based on ITS sequences and fatty acids
7、 analysis. FA Identification results accuracy rate was 99%. Through biological software of SPSS and Mega cluster analysis, fatty acids were found to be better for Bacillus identification than ITS sequences. In this paper, we could make all the strains cluster together, by FA, but ITS could not. The
8、major fatty acid of genus Bacillus was 15:0 ANTEISO and 15:0 ISO, author analyzed the major FA ratio of three group. Bacillus cereus group was special, its major FA was 15:0ISO, and 13:0ISO,but 15:0 ANTEISO had very lower profile. The ratio of Bacillus cereus group major 资助项目:资助项目: 国家 948 项目子专题:高效新型
9、微生物资源引进与创新(2011-G25) ;福建省科技项目公益专项:生物农药行业特色芽孢杆菌 资源库的建立及生防菌株的筛选应用(2009R10037-1) ; 作者简介作者简介:刘国红,博士生,研究方向为微生物分类。E-mail: 通讯作者:通讯作者:刘波,博士、研究员,从事生物技术与生物农药研究。电话:0591-87864601;E-mail: 收稿日期:收稿日期: ;接受日期:;接受日期: ;修回日期:;修回日期: 期刊文献 FA was 5.6-7.9. The ratio of Bacillus simplex group was 1/6. The ratio of Bacillu
10、s megaterium was 4/5-2, having similar amount of two major FA, and the rest Fas were very lower. The profile of 15:0ISO was lower than 15:0 ANTEISO in Bacillus subtilis group, and ratio was 1/3-2/3. The conclusion was that we can preliminary judge unknown strains through fatty acid. So, it was showe
11、d that fatty acids can be a fast, effective and simple method of classification and identification of genus Bacillus. Keywords: Bacillus species; fatty acid; ITS; classification and identification 芽胞杆菌是一大类表型特征不同的细菌群,如营养需求的多样性,生理与代谢多样性,DNA 碱基范围广。芽胞杆菌种类繁多,功能多样,在工业、农业、医学等各个领域都具有重要的作用。 因此研究芽胞杆菌分类具有重要的意义
12、。Priest 等1根据芽胞杆菌的表型特征进行数值分类,从而 将 368 株菌被分为 79 个群。同时,Woese 证明了 RNA 可以作为微生物分类的一把标尺,Ash 等 2利用 16S rRNA 将 51 种芽胞杆菌分为 5 群。但是,随着分类技术的发展,发现 16S rRNA 过于 保守,很难区分近缘种,而 rDNA 转录间隔区(ITS)弥补了 16S rRNA 的缺陷。Xu 等3利用 ITS 序列解释了芽胞杆菌科 6 个属 40 个种的系统发育关系,能准确的将芽胞杆菌近缘属区分开来,但 是,对于亲缘关系极相近的一些种,ITS 序列不能准确区分。 脂肪酸是微生物细胞组分中一种稳定而富有的
13、重要成分,它和细菌的遗传变异、毒力、耐药性 等有极为密切的关系,它的种类和含量是细胞化分类法的重要依据之一。Heyrman 等4(1999) 用脂肪酸对从壁画分离到的微生物进行分类,脂肪酸成分的分群充分表现了微生物的多样性。 Johannes5研究不同温度下简单芽胞杆菌脂肪酸的变化,分析了以色列进化谷中微生物的进化起源 关系。Alexandra 等6利用脂肪酸成分对 Legionella 属进行了数值分析,结果表明脂肪酸可以作为 该属分类的一个有效标记,能正确的将 Legionella 属不同的种以不同的分支代表。王秋红等7利用 气相色谱技术检测福建省 40 株青枯雷尔氏菌(Ralstonia
14、 solanacearum)菌株细胞内的脂肪酸,分析 发现其脂肪酸分布有明显的多态性,脂肪酸有望成为青枯雷尔氏菌小种鉴定的新指标,但构建芽胞 杆菌脂肪酸指数公式的研究还未见报道。本文比较了基于脂肪酸和 ITS 的两种鉴定方法,主要目的 是分析脂肪酸鉴定方法能否可以作为一种简单、准确的芽胞杆菌的鉴定和分类方法。 1 材料与方法材料与方法 1.1 供试菌株 供试菌株:芽胞杆菌菌株 4382,4388,4395,4396,4399,4404,4428,4481,4469,4470,4476,4495,4500,45 21, 4591,4540等16株从吉林、新疆、内蒙古、甘肃、西藏、陕西等地采集分离
15、得到(表1) , 保存于福建省农业科学院农业生物资源研究所。供试菌株在TSB培养基上28 培养24 h。 表 1 芽胞杆菌的采样地点和生境类型 Table 1 The sampling locations and habitat types of Bacillus species 序号菌株编号采样地点采样生境采集时间 1.4382吉林长白山天池土壤2007-07-30 2.4388吉林长白山大峡谷林地土壤2007-07-30 3.4395吉林长白山大峡谷林地土壤2007-07-30 4.4396吉林长白山大峡谷林地土壤2007-07-30 5.4399新疆阜北农场戈壁杂草根际土2007-10-
16、08 6.4404新疆阜北农场戈壁杂草根际土2007-10-08 7.4428新疆阜北农场戈壁白碱土2007-10-08 8.4481内蒙古呼尔浩特大草原根际土2006-07-31 9.4469内蒙古响沙湾沙漠土壤2006-07-31 期刊文献 序号菌株编号采样地点采样生境采集时间 10.4470内蒙古响沙湾沙漠土壤2006-07-31 11.4476内蒙古响沙湾沙漠土壤2006-07-31 12.4495内蒙古呼尔浩特大草原根际土2006-07-31 13.4500甘肃兰州黄河底土2006-08-04 14.4521西藏林芝古柏根际土2006-07-07 15.4591陕西省延安市宝塔山区树
17、林土2007-05-19 16.4540西藏林芝汞措湖菜地2006-07-07 1.2 芽胞杆菌 ITS 分子鉴定方法 DNA 的提取:菌纯化培养 24 h 后,划取菌落 2 环左右至装有 500 L 无菌水的离心管中,煮 沸 10 min,反复冻融 30 min,然后放入-20 冰箱贮存备用。PCR 扩增:PCR 扩增体系为 25 L:10Buffer 2.5 L,dNTP Mixture (10 mM)0.5 L,引物 F 1.0 L,引物 R 1.0 L,TaqDNA 酶(2.5U/L)0.3 L,DNA 1.0 L,ddw 18.7 L。ITS 基因序列扩增引物由上海生物 工程有限公司
18、合成,引物序列:L516SF:5-TCGCTAGTAATCGCGGATCAGC-3,L523SR:5- GCATATC GGT GTTA GTCCCGTCC-33。PCR 反应条件:95 预变性 45 s,94 变性 15 s,58 复性 30 s,72 延伸 90 s,30 个循环,72 延伸 10 min。PCR 产物经 1.5%琼脂糖凝 胶电泳检测。 1.3 芽胞杆菌脂肪酸鉴定方法 气相色谱系统采用的是美国 Agilent 7890N 型,包括全自动进样装置、石英毛细管柱及氢火焰 离子化检测器;分析软件应用美国 MIDI 公司开发的基于细菌细胞脂肪酸成分鉴定细菌的软件 Sherlock
19、MIS6.0(microbial identification system )。在下述色谱条件下平行分析脂肪酸甲酯混合物 标样和待检样本:二阶程序升高柱温,170 起始,5 /min 升至 260 ,而后 40min 升温 至 310 ,维持 90 s;汽化室温度 250 、检测器温度 300;载气为氢气(2 mL/min )、尾吹气 为氮气(30 mL/min);柱前压 10.00 psi(1psi=6.895 kPa);进样量 1 L,进样分流比 100:1。芽胞 杆菌细胞脂肪酸的提取试剂和方法参照 MIDI 操作手册8(Sherlock Microbial Identification
20、 System,Version 6.0) 。 1.4 数据处理 脂肪酸数据结果根据 SPSS16.0 进行处理,采用欧氏距离法做聚类分析。序列经 Clustal X9对 齐后,用软件 Mega 410,11进行聚类分析(方法为 Neighbour-Joining,Nucleotide: Jukes-Cantor) 。 2 结果与分析结果与分析 2.1 芽胞杆菌脂肪测定结果 16 株芽胞杆菌的脂肪酸检测结果如 表 2和表 3 所示,根据脂肪酸成分将 16 株菌分为四大类群:类群 I 蜡状芽胞杆菌、类群 II 巨 大芽胞杆菌、类群 III 简单芽胞杆菌及类群 IV 枯草芽胞杆菌。通过 Sherlo
21、ck 脂肪酸鉴定系统共检测 出 20 种脂肪酸,主要脂肪酸类型为 15:0ISO 和 15:0 ANTEISO。其余脂肪酸类型和含量详见 表 2和表 3。 , 表 2 16 株芽胞杆菌的脂肪酸类型和百分含量 Table 2 The fatty acid profiles of 16 strains of Bacillus species 类群类群 I类群类群 II脂肪酸类型脂肪酸类型 43824388454044764395439644694500 1.ISO 17:1 10C6.936.2602.771.841.590.191.09 期刊文献 脂肪酸类型脂肪酸类型类群类群 I类群类群 II
22、43824388454044764395439644694500 2.ISO 17:1 5C01.6404.040000 3.12:0 ISO1.551.131.101.570000 4.13:0 ANTEISO1.881.671.301.570000 5.13:0 ISO11.3116.6210.0215.480.500.580.500 6.17:1 ISO 10C009.2400000 7.14:05.164.152.943.941.261.992.210.88 8.14:0 ISO6.943.803.325.345.914.797.181.18 9.15:0 ANTEISO3.872.8
23、43.044.3433.3234.0640.6627.25 10.15:0 ISO21.7222.3120.4831.0941.9438.3432.0352.34 11.16:07.1510.2811.183.842.273.315.143.37 12.16:0 ISO6.355.426.745.790.770.611.792.01 13.16:1 11C1.881.752.1204.274.7820.94 14.16:1 7C ALCOHOL1.561.321.720.91.631.260.740 15.17:0 ANTEISO1.241.211.571.072.292.43.134.21
24、16.17:0 ISO5.97.6811.976.561.381.261.826.74 17.18:00.831.011.3800.501.501.070 18.16:1 ISO I/14:0 3OH / 16:1 ISO I / 14:0 3OH1.290.650.782.260000 19.15:0 ISO 2OH/16:1W7C / 15:0 ISO 2OH / 16:17C5.557.4708.710000 20.17:1 ISO I/ANTEI B / 17:1 ISO I / ANTEI B00001.581.510.270 表 3 16 株芽胞杆菌的脂肪酸类型和百分含量 Tabl
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