论文-陈菲菲.doc
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1、南京医科大学硕士学位论文白芍总苷对小鼠接触性皮炎的作用及机制研究前 言接触性皮炎是皮肤、粘膜单次或多次接触外源性物质后,在接触部位甚至以外的部位发生的炎症性反应1,是皮肤科常见病、多发病,包括由化学性刺激引起的刺激性接触性皮炎和型变态反应引起的变态反应性接触性皮炎。刺激性接触性皮炎是指接触物对皮肤有很强的刺激性,任何人接触后均可发生皮炎;变态反应性接触性皮炎是指接触物基本上是无刺激性的,少数人在接触该物质致敏后,再接触该物质,经12-48h在接触部位及其附近发生皮炎。变应性接触性皮炎是由T细胞介导的抗原特异性皮肤过敏反应,以抗原刺激后局部皮肤出现一系列的皮肤炎症细胞浸润、炎症介质释放为特征。不
2、少文献肯定了型T淋巴细胞(包括CD4+Th1细胞和CD8+Tcl细胞)因子在变应性接触性皮炎病变过程中的作用,但近来也有不少文献指出,型/型(包括CD4+Th2细胞和CD8+Tc2细胞)T淋巴细胞因子的动态改变,影响了变应性接触性皮炎的发展和转归。细胞因子可以活化局部内皮细胞,趋化淋巴细胞,上调主要组织相容性复合体(MHC)、协同刺激因子和黏附分子的表达,在变应性接触性皮炎的发生、发展和转归中起重要的作用2,3。在变应性接触性皮炎发病中,I型细胞因子TNF-起重要作用。TNF-基因敲除的小鼠或者应用TNF-中和抗体,均不能够产生明显的变应性接触性皮炎反应4。TNF-对LC从表皮向回流淋巴结的移
3、动和回流淋巴结内树突状细胞的聚集起主要的作用3。TNF-还是重要的炎症前介质,可以诱导炎症反应中多种细胞因子的产生、黏附分子(如ICAM-1)和协同刺激因子的表达5,6。也是诱导NF-B活化的重要细胞因子7。NF-B是一类能特异性地识别结合DNA的Rel类蛋白质二聚体转录因子8。NF-B可能作为始发炎症反应的上游环节在疾病中起重要作用。NF-B作为一种促进基因转录的核转录因子,参与调节、控制免疫反应及其进程的信号传导途径;各种体内、外因素如各种微生物及病毒的代谢产物、炎性细胞因子、T细胞及B细胞的表面分子等均可使其活化9。活化的NF-B参与机体多种蛋白、酶及细胞因子的基因转录10、免疫与炎症反
4、应的调节过程,如抗原递呈、T与B细胞的激活及类型转换以及免疫平衡的稳定。NF-B通过对白细胞介素-1(IL-1),IL-2, IL-6,肿瘤坏死因子(TNF-)、诱导型一氧化氮合酶( iNOS )、环加氧酶-2(COX-2 )、细胞间黏附分子-1( ICAM-1)等诱导性调节作用参与免疫细胞的增殖、分化及免疫应答。此外,免疫细胞内NF-B活性的改变还直接影响免疫细胞的活化、增生和凋亡。因此NF-B的激活就可以作为炎性反应的触发器及关键环节,诱导机体一系列炎性反应因子的产生9,最终导致炎性病理损伤。CD1a是郎格汉斯细胞(Langerhans cells,LC)的标记性分子,而LC的抗原递呈功能
5、在变应性接触性皮炎的发病过程中起重要的作用。在变应性接触性皮炎发病过程中,每种细胞因子的作用都不是单一的,对变应性接触性皮炎的抑制或者促进作用也不是绝对的。各种细胞因子之间可以通过合成分泌相互调节、受体表达相互调控、生物学效应相互影响,从而调节变应性接触性皮炎病理过程的进展和转归。治疗变应性接触性皮炎的方法是在识别致病原的前提下,去除或避免再次接触致病原。然而在实际治疗中致病原往往难以发现,或者由于变应性接触性皮炎患者有时不能圆满改善他们与变应原接触的现状,也不能随意改变工作种类,于是应用皮质激素治疗成为首选,但皮质激素的不良反应限制了其推广和应用。白芍为芍药的干燥根,白芍总苷( total
6、glucosides of paeony,TGP)为白芍中提取的有效成分,主要含有芍药苷、芍药内酯苷、羟基芍药苷、苯甲酰芍药苷等单萜苷类化合物。白芍总苷的药理及临床研究发现,白芍总苷具有止痛、抗炎、保肝,以及多途径抑制自身免疫反应等多种药理作用,对类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮等自身免疫病有确切疗效。现代药理研究证实,TGP可抑制大鼠腹腔巨噬细胞分泌TNF-,IL-1,IL-2,No,产生抗炎作用11。为了了解白芍总苷在变应性接触性皮炎治疗中的作用及可能产生的作用机制,本研究通过建立小鼠变应性接触性皮炎模型,观察白芍总苷对小鼠变应性接触性皮炎大体形态变化和组织病理学改变,通过测定细胞因TNF-
7、的水平以及观察NF-B、CD1a在小鼠耳组织中的表达,初步探讨白芍总甘治疗变应性接触性皮炎的可能性及作用机制。材料和方法1材料1.1动物实验用小鼠为扬州大学医学院动物中心提供的昆明小鼠42只,雌雄各半,6-8周龄,体重25-30g。等级:清洁剂。小鼠饲养于金属笼中,随意饮食、饮水,周围温度20,湿度60%。1.2 主要试剂和试剂盒2,4-二硝基氟苯(Sigma Aldrich公司)、白芍总苷(宁波立华制药公司)、地塞米松片(浙江仙琚制药股份有限公司)、TNF-ELISA试剂盒(武汉博士德公司)、NF-B、CD1a免疫组化试剂盒(武汉博士德公司)。1.3 实验器材与仪器皮肤圆形打孔器(直径6mm
8、)、电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司)、数显游标卡尺(北京北量量具机电有限公司)、微孔板酶标仪、酶标仪洗板机。2 实验方法2.1小鼠变应性接触性皮炎模型建立:2.1.1 DNFB配备:250mg DNFB加入4:1体积比的丙酮与橄榄油混合液50ml,配成0.5%的DNFB溶液致敏。将250mg DNFB加入4:1体积比的丙酮与橄榄油混合液125ml,配成0.2%的DNFB溶液诱发皮炎。2.1.2取昆明小鼠10只,雌雄各半,小鼠于实验前一天在腹部备皮2cm1.5cm,用8%硫化钠水溶液脱毛,生理盐水充分擦洗。实验第一天、第二天在腹部去毛部位均匀涂布0.5%的25L DNFB溶液致敏。实验第
9、6天在小鼠的左耳腹、耳背面涂布0.2%的20L DNFB溶液诱发皮炎。右耳涂布20L基质12。建立小鼠变应性接触性皮炎模型。实验第7天观察小鼠左耳大体形态变化,处死后取左耳皮损行组织病理检查,判定造模是否成功。2.2白芍总苷对小鼠变应性接触性皮炎模型的影响2.2.1 实验分组:造模成功后,32只小鼠被随机分为4组,分别为空白组、模型组、地塞米松组和白芍总苷组,每组8只。其中空白组未做任何处理。2.2.2 DNFB诱发模型:小鼠于实验前一天在腹部备皮2cm1.5cm,用8%硫化钠水溶液脱毛,实验第一天、第二天模型组、地塞米松组和白芍总苷组小鼠在腹部去毛部位均匀涂布0.5%的25L DNFB溶液致
10、敏。实验第六天在小鼠的左耳腹、耳背面涂布0.2%的20L DNFB溶液诱发皮炎。右耳涂布20L的基质12。2.3 给药方法 白芍总苷组小鼠体重用药量为30g左右小鼠18mg/d(药物剂量按每千克体质量为中华人民共和国药典规定临床用量的20倍),溶于0.5%羧甲基纤维素溶液中,将药物浓度校正到实验中每30g小鼠体质量灌胃量为4ml,每次取0.4ml灌胃。地塞米松体重用药量为30g左右小鼠0.09mg/d(按成人每天地塞米松9mg,小鼠用药量为20倍),溶于0.5%羧甲基纤维素溶液中,每次取0.4ml灌胃。模型组每次予以生理盐水0.4ml灌胃。实验第一天起各组自第一次涂药前2小时灌胃,连续用药五天
11、,每天一次。实验第六天涂药前2小时及涂药后6小时灌胃各一次。所有小鼠于第七天采用眼球摘除法处死并取血备用。测量小鼠双耳中部厚度,用皮肤圆形打孔器沿小鼠左耳耳缘中部打孔,所取左耳组织一分为二,置于福尔马林中备用。一部分切片H-E染色,组织病理检查,一部分行免疫组化检查。2.4 观察指标2.4.1 耳厚度差:数显游标卡尺测量小鼠双侧耳中部的厚度,计算诱发后左右耳厚度差。2.4.2 H-E染色及观察 处死后取小鼠左耳组织常规石蜡切片,H-E染色。用光镜观察H-E染色切片中有无病理变化和各组织间有无差异,并观察染色切片中细胞类型的变化及差异。2.4.3 NF-Bp65在皮损处的表达:小鼠左耳组织进行常
12、规石蜡包埋,连续切片。采用免疫组化的方法检测小鼠左耳皮损处NF-Bp65的表达:2.4.3.1液体配置:95%乙醇(95ml纯乙醇加5ml蒸馏水)、85%乙醇(85ml纯乙醇加15ml蒸馏水)、75%乙醇(75ml纯乙醇加25ml蒸馏水)、PBS配方:Nacl 8.0g,Kcl 0.2g。12H2ONa2PO4 3.63g,KH2PO4 0.24g加1000ml蒸馏水、免疫组化专用PBS(PH7.2-7.6):1000ml蒸馏水中加Nacl8.5g,Na2HPO42.8g,NaH2PO40.4g(如果用的复合水的磷酸盐,应加上分子式中水的含量)、0.01M枸橼酸盐缓冲液:PH=6.0左右,10
13、00ml蒸馏水,枸橼酸三Na(C6H5Na3O72H2O)3g,枸橼酸(C6H8O7H2O)0.4g、显色液:在试管中先加1ml1HRP反应缓冲液,然后依次加入试剂A50ul,试剂B50ul,试剂C50ul混匀。2.4.3.2步骤:60烤箱烘片(小鼠左耳组织石蜡切片)35min,脱蜡 二甲苯3次,每次15min。梯度乙醇:100%乙醇 25-8min,95%乙醇25-8min,85%乙醇15-8min,75%乙醇15-8min,3%H2O2 室温10-15min,蒸馏水35-8min。抗原修复:将切片浸入0.01M枸橼酸盐缓冲液(PH6.0),加热(微波炉)至沸腾后盖紧高压锅至气体喷出后1-2
14、min,切断电源,冷却后,打开锅盖取出标本。PBS冲洗2min3次。5-10%BSA封闭液封闭,每个标本加入约100ul,3730min,甩去封闭液不洗,将切片分为两组,一组均加一抗,一组为阴性对照,不加一抗(一抗1:100用PBS稀释)。4过夜。PBS洗32min。两组切片均加二抗(山羊抗小鼠IgG约100ul),37 20min,PBS洗32min,滴加试剂SABC 37 20min,PBS洗45min,DAB显色,反应10-20S,蒸馏水洗涤。将切片置于苏木精染色1min,取出用40-50温水洗涤,95%乙醇5-8min,100%乙醇5-8min,二甲苯5-8min脱水,透明,待充分干燥
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