青枯雷尔氏菌Ralstoniasolanacearum绿色荧光蛋白标记研究.doc
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1、11期 车建美等:含绿色荧光蛋白标记的青枯雷尔氏菌确良(Ralstonia solanacearum)青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum) 绿色荧光蛋白标记研究车建美1,2,蓝江林1,刘 波1(1福建省农业科学院农业生物资源研究所,福州 350003;2福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室,福州 350002)摘要:【目的】采用电击法对青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)进行gfp/luxAB基因双标记,研究标记前后菌株的生长差异、以及侵染性和致病性的变化。【方法】通过电击法进行青枯雷尔氏菌的遗传转化,采用番茄组培苗对标记菌株的侵染条
2、件和侵染过程进行初步研究。【结果】成功地采用gfp/luxAB基因标记了青枯雷尔氏菌。标记后的菌体细胞形状与亲本菌株形状相同,均为长椭圆形,近杆状,整个细胞呈现绿色荧光,PCR结果表明,从标记青枯雷尔氏菌菌株的基因组DNA中扩增出约3.0 kb的gfp基因片段。标记菌在对数生长期,荧光素酶活性快速增加,到稳定期,荧光素酶活性降低。在无选择压力条件下连续移植20次,仍然保持均匀而且强烈的绿色荧光,荧光稳定性保持在100%。gfp基因标记前后的菌株在培养的最适温度、最佳pH值及生长曲线上基本一致,在番茄组培苗内的侵染路线相同,致病力均达到90%以上。【结论】利用gfp和luxAB融合基因成功转入青
3、枯雷尔氏菌,融合基因在标记菌株中的表达高效稳定。导入的gfp基因对宿主的生长特性及致病性没有影响。关键词:青枯雷尔氏菌;电击法;gfp/luxAB基因GFP Tagging Ralstonia solanacearum with gfp/luxAB mini-Tn5CHE Jian-mei1,2, LAN Jiang-lin1, LIU Bo1(1Agricultural Bioresource Research Institute, Fujian Academy of Agricultural Sciences, Fuzhou 350003; 2Key Laboratory of Biope
4、sticide and Chemical Biology, Fujian Agricultrue and Forestry University, Ministry of Education, Fuzhou 350002)Abstract: 【Objective】The Ralstonia solanacearum strain was chromosomally tagged with the marker genes gfp and luxAB by electroporation. The growth properties and the pathogenicity of the ta
5、gged strain and the wild type strain were compared in this paper.【Method】The R. solanacearum strain was transformed by the electroporation. The condition and processor of the invasion of the GFP-tagged strain was observed in the tomato tissue culture plants. 【Result】 Transformant was screened for th
6、e green fluorescence by fluorescence stereomicroscopy. A 3.0 kb fragment of the gfp gene and luxAB gene was amplified from the genome DNA of the GFP-tagged strains. Morphologically, the cells of the engineered strain were similar to wild type strain as determined by laser scanning confocal microscop
7、y. Luciferase activity of the GFP-tagged strain increased rapidly during the log phase, but decreased in the stationary phase. The green fluorescence could be kept until 20 times of subcultures. It was the same for the GFP-tagged strian and the wild type strain in the culture temperature, pH value a
8、nd growth curve. These results confirmed that the dual marker was inserted successfully into the R. solanacearum strain. The pathogenicity of the wild type strain and the GFP-tagged strain was over 90% which means gfp gene had no effect on the pathogenicity. 【Conclusion】The GFP-tagged R. solanacearu
9、mis obtained in this study. The growth propertities and the pathogenicity of the GFP-tagged strain is the same to the wild type strain.Key words: Ralstonia solanacearum; Electroporation; gfp/luxAB gene0 引言【研究意义】植物细菌性青枯病是由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的一种毁灭性的土传细菌病害。青枯雷尔氏菌寄主广泛,可侵染44个科数百种植物1。植物青枯细菌致病
10、的分子机制是植物与微生物相互作用机制研究的重要领域之一。在植物根际土壤中和植株体内存在着大量的青枯雷尔氏菌,这给青枯雷尔氏菌侵染致病机理的研究带来了困难。将gfp基因转入青枯雷尔氏菌将有助于研究青枯雷尔氏菌在活体植物体内的侵染过程,建立菌体生物量的直观测定方法,从而为更加深入地研究青枯雷尔氏菌致病机理及青枯病生物防治机制奠定基础。【前人研究进展】绿色荧光蛋白(GFP)最早是从水母中分离出来的,是一种非酶性报告因子,该蛋白能够自身催化形成发色结构并在紫外或蓝光激发下发出绿色荧光,作为报告基因,GFP是目前能在活细胞中表达的发光蛋白之一,作为荧光标记分子,GFP既具有敏感的标记检测率,又没有放射性
11、的危害2。GFP检测方便,荧光稳定,易于构建载体且对活细胞无毒害,对目的基因的功能也没有影响,转化后细胞可以继续传代2。利用GFP标记进行病原菌侵入活体细胞过程的跟踪观察更开创了病理学研究的新时代35。Unge等6的研究证明了荧光与菌体细胞数量呈线性关系,也为通过荧光直接对细菌记数提供了一个方便快捷的方法。gfp基因在其它细菌上的转化有过许多报道,但是,青枯雷尔氏菌gfp基因转化非常困难,国内外许多学者都试图进行青枯雷尔氏菌gfp基因转化,然而,成功的例子非常少,通过NCBI检索,仅见两篇关于gfp基因转入青枯雷尔氏菌的报道7,8,一篇是采用自然转化的方法将来自AW1-gfp38菌株的Tn5:
12、gfp转入青枯雷尔氏菌K607,另一篇则采用细胞融合的转录方法将hrp-gfp基因转入GMI10008。【本研究切入点】未见关于采用电击转化法进行青枯雷尔氏菌的gfp基因转化的报道。目前在国内未见关于青枯雷尔氏菌gfp基因转化的报道。【拟解决的关键问题】在本研究中,作者采用带有gfp/luxAB双标记基因的pUT mini-Tn5转座载体,通过电击转化法成功地将它整合到青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)染色体上,并利用荧光显微镜检测GFP在标记菌中表达后发出的绿色荧光,同时进行了转化菌体的gfp基因检测和转化菌株的微生物学异质性检测,研究转化菌株的生物学稳定性,为青枯
13、雷尔氏菌gfp基因转化和致病机理的研究提供方法。1 材料与方法1.1 试验材料1.1.1 菌株和质粒 青枯雷尔氏菌(R. solanacearum)编号Rs91菌株为本实验室从番茄植株上分离纯化得到并保存。大肠杆菌(Escherichia coli)CC118为转座载体pUT gfp/luxAB的宿主菌,由瑞典农业大学微生物系Janet K. Jasson教授惠赠,其中带有双标记基因gfp/luxAB 9,质粒图谱见图1。图1 质粒pUT gfp/lux图谱Fig. 1 The map of pUT gfp/lux1.1.2 培养基、抗生素与试剂 大肠杆菌(E. coli)CC118的培养基为
14、LB培养基;青枯雷尔氏菌的培养基为0.1TSB;质粒大量提取及纯化试剂盒为德国QIAGEN公司的QIAGEN Plasmid Maxiprep Kit;抗生素卡那霉素(Kanamycin,Km)购自Sigma公司;电转化仪为Bio-Rad Gene Pulser ;立体荧光显微镜(Leica MZ12)为瑞士莱卡仪器公司产品。凝胶成像仪BIO-RAD Universal Hood Gel-Doc UV Imaging System、离心机为德国生产的Hettich mikro200R。引物gfplux Forw Not I(5-gcggccgcataggta aaggagaagaac tttt
15、cact -3)和引物gfplux Rev Not I(5-gcggccgct tacgag tggtatttgacgatgtt-3)由美国Invitrogen公司合成。1.2 试验方法1.2.1 青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的gfp基因转化1.2.1.1 质粒的提取 参照文献10。质粒提取及纯化步骤按QIAGEN质粒大量提取试剂盒提供的方法进行。采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测,上样量为2 l。1.2.1.2 青枯雷尔氏菌感受态细胞的制备 从0.1 TSB固体平板上挑取新鲜的青枯雷尔氏菌单菌落于20 ml 0.1TSB液体培养基中,30,150 r/min振荡培养
16、过夜,按照1%接种比例接入500 ml 0.1TSB液体培养基中,30,150 r/min振荡培养,每1 h测定1次OD600。收集生长中期的培养物于冰水浴中放置30 min后,用无菌水冲洗细胞4次,最后将细胞悬浮于1 ml无菌水中,并在70冰箱保存备用。1.2.1.3 青枯雷尔氏菌的电击转化 参照文献10。电击转化后取200 l菌液涂布于含有50 gml-1卡那霉素的0.1TSB固体培养基上,30培养。电击转化的参数为:电压2.5 kV、电容25 F、电阻400 。1.2.1.4 阳性转化子的荧光检测及激光共聚焦显微检测 检测方法参照文献11。通过观察菌落发出的绿色荧光直接筛选阳性转化子,命
17、名为Rs91-GFP。1.2.2 青枯雷尔氏菌Rs91-GFP的鉴定及荧光检测 1.2.2.1 Rs91-GFP的PCR检测 引物gfplux Forw Not I和引物gfplux Rev Not I(由瑞典农业大学Janet教授组内博士生设计,该引物可扩增gfp和lux片段的全部序列)。采用灭菌的牙签挑取少许新鲜培养的单菌落加入25 l PCR反应体系中。25 l PCR反应体系中含有2 l 10Buffer;1 l 2 mmolL-1dNTPs;1 l 10 mmolL-1引物。所用模板DNA分别为Rs91-GFP基因组DNA、Rs91基因组DNA(阴性对照)、以及质粒DNA(阳性对照)
18、。PCR循环参数为:94 预变性 2 min;进入94 10 s,60 30 s,68 8 min,共10个循环;然后进入94 15 s,60 30 s,68 8 min,共20个循环;最后68延伸10 min。采用1%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,上样量为3 l,最后用Bio-Rad 2000型凝胶成像仪拍摄。1.2.2.2 Rs91-GFP的荧光素酶活性检测 按照1%的比例将过夜培养的Rs91-GFP培养液接入0.1TSB液体培养基中(含有50 gml-1 Km),置30、150 r/min恒温摇床振荡培养,每2 h测定1次荧光素酶活性。荧光素酶测定方法参照文献9。试验重复3次。1.2.
19、3 Rs91-GFP的稳定性检测 按照1%的比例将过夜培养的Rs91-GFP培养液接入0.1TSB液体培养基中,置30、150 r/min恒温摇床振荡培养,每12 h移植1次,连续20次,分别于第2、8、12、16和20次,适当稀释涂布于0.1TSB固体培养基上,培养48 h后统计菌体数量并于荧光显微镜下观察GFP表达情况。1.2.4 青枯雷尔氏菌Rs91-GFP菌株的生长特性1.2.4.1 Rs91-GFP生长曲线的测定 按照1%的比例将新鲜培养的标记前后的菌株培养液接入0.1TSB液体培养基(含有50 gml-1 Km)和0.1TSB液体培养基中。置30、150 r/min恒温摇床振荡培养
20、,每隔1 h取样,用UV-2550紫外分光光度计测定OD600值,试验重复3次。1.2.4.2 培养温度对Rs91-GFP生长的影响 将培养好的Rs91-GFP接入0.1TSB液体培养基(装瓶量25 ml/250 ml),接种量为1%,分别于25、30、35、40、45、200 r/min摇床培养。1.2.4.3 初始pH对Rs91-GFP生长的影响 先将0.1TSB液体培养基(装瓶量25 mL/250 mL)的pH值调为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0,将培养好的Rs91-GFP接入液体培养基,接种量为1%,于30,150 r/min恒温摇床培养。所有生长特性的测定试验均在培养3 h后
21、测定OD600值。调零对照为0.1TSB液体培养基,另一对照为Rs91。1.2.5 青枯雷尔氏菌Rs91-GFP菌株的定殖和侵染特性1.2.5.1 温度对Rs91-GFP菌株定殖的影响 Rs91- GFP菌株于0.1TSB液体培养基中,30下振荡培养48 h,取培养也配制成103 cfu/ml的孢子悬浮液,备用。番茄组培苗至45片真叶长出。挑选长势均一的组培苗,用无菌的组培刀伤根,接入菌液,以清水处理为对照,每处理接3瓶(每瓶3株苗),分别置于19,22,25,28和31培养。取整株苗称重,按比例稀释,每个样品选择两个稀释度,吸取0.1 ml均匀涂布0.1TSB平板上。将涂布好的平板放入30的
22、培养箱中培养,观察平板上菌的生长情况。待平板上的菌落明显形成且易计数时,取出统计平板上单菌落数量。1.2.5.2 Rs91-GFP菌株在番茄组培苗体内转移路线的测定 Rs91-GFP菌株的培养同上。番茄组培苗至45片真叶长出。挑选长势均一的组培苗,用伤根法接菌6瓶(每瓶3株苗),以清水处理为对照。接菌9 h后,每3 h取1瓶,取根部,基部和上部茎,叶片分别称重研磨,按比例稀释(具体稀释倍数视样品而定),Rs91-GFP的培养方法同上。1.2.5.3 Rs91-GFP菌株对番茄组培苗致病性影 响 Rs91-GFP菌株的培养及番茄组培苗的接菌方法同上。将组培苗置于30培养,每天观察组培苗的生长状况
23、,统计组培苗的萎蔫及死亡率。2 结果与分析2.1 pUT gfp/luxAB质粒DNA的提取通过琼脂糖凝胶进行电泳,得到1条条带,质粒DNA的分子量为10 kb左右。所提取的质粒DNA未见拖尾,说明质粒提取效果较好,没有杂菌污染和宿主DNA污染,因此,可以用于青枯雷尔氏菌的转化研究(图2)。M: Marker; P: pUT gfp/lux图2 质粒pUT gfp/lux的电泳图谱Fig. 2 The plasmid of pUT gfp/lux2.2 GFP标记的青枯雷尔氏菌的获得及转化子的荧光检测本研究成功地将gfp/luxAB双标记基因整合到青枯雷尔氏菌Rs91染色体上,得到绿色荧光蛋白
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