髓鞘少突胶质细胞糖蛋白MOG抗原肽免疫原性验证.doc
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1、 大学毕业论文 题 目:髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 MOG 抗原肽 免疫原性验证 学生姓名: XXX 学号: XXXXXXXXX 指导教师: XXX 职称: 教授 专 业: 生物技术 院(系): 生物工程系 完成时间: 2011 年 5 月 25 日 2011 年 5 月 25 日 摘要摘要 目的: 通过实验性自身免疫性脑脊髓炎(Experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)小鼠模型的建立,验证固相合成法制备的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)抗 原肽免疫原性。并通过观察 EAE 病理学变化,初步探讨多发性硬化(MS)的发病机制。 方法: 本实验室利用
2、 Fmoc 固相合成法制备的 MOG3555抗原肽(纯度95%)加完全弗氏 佐剂(CFA)免疫 C57BL/6 小鼠,观察小鼠发病情况,并采用双盲法进行神经功能评 分。利用电子显微镜观察 EAE 小鼠的病理学变化,分别采用 HE 染色、Luxol Fast Blue 髓鞘染色法评估脊髓中炎性细胞的浸润及髓鞘脱失的情况。 结果: MOG3555成功诱导了 C57BL/6 小鼠 EAE 模型。免疫后 15 天起,小鼠开始陆续出 现临床症状,至第 21 天发病率达 100%。电子显微镜下可见 EAE 小鼠脊髓中典型脱髓 鞘现象,并伴随有典型的炎性细胞的浸润。 结论: 用本实验室合成的抗原肽 MOG3
3、555诱导的 C57BL/6 小鼠 EAE 模型,发病率高, 模型稳定,为进一步研究多发性硬化(multiple sclerosis, MS)的发病机制与治疗打下基 础。 关键词关键词:髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、实验性自身免疫性脑脊髓炎、动物模型、神经病理 学 I Abstract Objective The model of experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE) was established in female C57BL/6 mice to validate the immunogenicity of myelin oligodend
4、rocyte glycoprotein (MOG), to observe pathological changes of EAE, and to explore the possible pathogenesis of multiple sclerosis(MS). Methods Each mouse was injected s.c over flanks with MOG35-55, Mycobacterium H37Ra, and CFA, injected i.p with pertussis toxin. The clinical symptoms were observed a
5、nd the pathological changes of EAE were studied with the electron microscopy. Consecutive sections were stained with hematoxylin/eosin(HE) and Luxol Fast Blue(LFB), to assess inflammation and demyelination. Results The incidence of EAE in immunization animal reached 100%, most mice developed clinica
6、l EAE with in about 15 days of immunization MOG3555 peptides. With Electron microscopy, inflammatory cells in white matter and demyelination were observed. And the component of axon is disappeared. Conclusion The immunogenicity of MOG3555 synthesized by the improved solid-phase synthesis method was
7、identified by the induction of EAE in C57BL/6 mice with stable performance and high incidence, which may be helpful in exploring the mechanism and therapy of Multiple sclerosis(MS). Key Words: Myelin oligodendrocyte glycoprotein(MOG), Experimental autoimmune encephalomyelitis(EAE), Mouse models, Pat
8、hological changes II III 目录目录 引言引言1 一、材料和方法一、材料和方法2 1. 试剂和仪器2 1.1. 主要试剂2 1.2 主要仪器2 2. 实验动物.2 2.1 小鼠来源2 2.2 饲养3 3. EAE 小鼠模型的制备3 4. 神经功能评分3 5. 脊髓组织病理学检测取材3 6. 溶液的配制3 7. H&E、LFB 染色4 7.1 H&E 染色.4 7.2 LFB 染色.4 8. 数据分析及统计学处理5 二、实验结果与分析二、实验结果与分析.5 1. 临床评分.5 2 病理学检测结果.6 2.1 H&E 结果.6 2.2 LFB 的结果.7 三、讨论三、讨论.8
9、 参考文献参考文献.10 致谢致谢12 IV 0 引言引言 实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE)是研 究多发性硬化(multiple sclerosis, MS)的经典动物模型,是由同种型、同种异型、异种 型神经组织抗原诱导的中枢神经系统(central nervous system, CNS)白质免疫炎性脱髓鞘性 模型。其病理特征和 MS 相似,均表现为 CNS 白质脱髓鞘改变和炎性细胞浸润。 制备 EAE 动物模型的方法多种多样,可通过注射 CNS 髓鞘、特定的髓鞘蛋白或其 选择肽段加完全弗氏佐剂主动诱导;
10、或转移已致敏的 CD4+T 细胞进行过继免疫诱导。诱 导 EAE 由于不同的致敏原,动物品系或诱导方法可以诱导产生不同类型或不同程度的 EAE,所以制备 EAE 动物模型的方法多种多样。目前报道较多的 EAE 模型动物是 Lewis 大鼠、SJL/J 小鼠、B10.PL 小鼠和 PL/J 小鼠等。但国内不易获得这些啮齿类动物,因而 在制作 EAE 动物模型时均不作为首选。 C57BL/6 小鼠也是具 EAE 敏感特性的品系之一,其对髓鞘少突胶质细胞糖蛋白 (MOG)的敏感抗原表位是 3555 位氨基酸。MOG3555抗原肽含 21 个氨基酸,分子量为 2582.4 道尔顿,是唯一既能引起脱髓鞘
11、抗体反应又能引起 T 细胞反应的中枢神经系统髓 鞘蛋白成分。虽然 MOG 在髓鞘蛋白中含量很少,但由于它存在于髓鞘膜和少突胶质细 胞的最外层,故具有高度免疫原性。近年来用 MOG 诱导的 EAE 逐渐成为国际上研究 MS 的主要模型。参照国内外文献报道的方法,结合本实验室的条件加以改进,拟采用 MOG3555作为抗原,辅以腹腔注射百日咳毒素,以期成功构建 C57BL/6 小鼠 EAE 模型, 来验证其免疫原性;并采用双盲法进行神经功能评分,利用电镜观察 EAE 小鼠的病理学 变化,分别采用 HE 染色、Luxol Fast Blue 髓鞘染色法评估脊髓中炎性细胞的浸润及髓鞘 脱失的情况。 1
12、一、材料和方法 1. 试剂和仪器 1.1. 主要试剂 MOG35-55多肽 MEVGWYRSPFSRVVHLYRNGK 由本实验室合成,合成纯度 HPLC95%,完全弗氏佐剂(CFA, Chodrex),百日咳毒素(Pertussis toxin, Sigma), 结晶紫 Cresyl viole(Sigma),碳酸锂(上海华硕精细化学品有限公司),坚牢兰 Luxol- fast-blue(Alfa Aesar),伊红 Y(kermel),PBS 缓冲液(0.01M,PH7.4),苏木素(郑州 派尼化学试剂厂),多聚赖氨酸(Sigma),多聚甲醛(Kermel),无水乙醇,甘油。其 它试剂均为
13、国产分析纯。 1.2 主要仪器 TDL80-2B 离心机(Anke),超净工作台(苏州净化设备有限公司),电子天平 (Sartorius),微量移液器(德国 Eppendorf 公司),4C 冰箱(Siemens),微波炉 (海尔),冰盒,2ml、5ml 玻璃注射器(上海鸽牌玻璃厂),医用一次性三通管(德国 贝朗医疗股份有限公司),Olympus BX51 荧光显微镜(日本 Olympus 公司),Leica 石 蜡切片机(Leica,RM2145),手术器械(眼科剪、眼科镊、手术刀等)。 2. 实验动物 2.1 小鼠来源 健康 68 周龄的雌性野生型 C57BL/6(H-2b)小鼠(SPF
14、级)共 16 只。体重 1618g,购 自中国医学科学院血液学研究所实验动物中心,许可证号:SCXK(津)2004-0001。正 常组:8 只,不作任何处理,EAE 病理模型组 8 只,诱导 EAE 模型。 2.2 饲养 在大学生物工程系 SPF 级动物房中饲养、繁殖,幼鼠至八周龄后进行实验。 2 3. EAE 小鼠模型的制备 C57BL/6 小鼠随机分为 EAE 组和正常组,各 8 只。MOG3555多肽用 PBS 稀释后与 完全弗式佐剂(结核杆菌的终浓度为 4mg/ml)按等体积混合,用注射器反复推拉成油包 水的乳剂,每只小鼠注射 0.2ml 乳剂,其中 MOG3555多肽剂量为 300g
15、/只,分别于鼠 背部两侧皮下注射;在第 1 次免疫后 0 小时和 48 小时腹腔注射百日咳毒素稀释液 0.1ml,200ng/只。正常组不做任何处理。 4. 神经功能评分 自免疫当天开始,每日称体质量,观察小鼠的摄食情况,并从初次免疫第 0 天起至 第 31 天实验终止前,采用盲法,每天 2 人至少 1 次在同一时间按 Benson 评分标准,对 EAE 严重性进行临床评估,评分2 分以上者(包括 2 分)进行发病率的计算。1 级:尾 部无力或蹒跚步态伴尾部有力;2 级:蹒跚步态伴尾部无力(共济失调);2.5 级:共济 失调伴部分单肢麻痹;3 级:单肢完全麻痹;3.5 级:单肢完全麻痹伴另一肢
16、体部分麻痹; 4 级:双肢完全麻痹;4.5 级:四肢麻痹;5 级:死亡。 5. 脊髓组织病理学检测取材 在 EAE 模型发病的高峰期,将小鼠脱颈处死,迅速取其脊髓,置于 4%的多聚甲醛 中固定,0.1mol/l PBS 24 小时、70%酒精 30 分钟、95%酒精 I 60 分钟、95%酒精 II 60 分 钟、100%酒精 I 60 分钟、100%酒精 II 60 分钟、60C 二甲苯 I 60 分钟、60C 二甲苯 II 60 分钟、60C 石蜡 I 60 分钟、60C 石蜡 II 60 分钟后包埋。将石蜡包块用切片机连续切 成 34m 切片,分别作 H&E 染色、LFB 髓鞘染色。 6
17、. 溶液的配制 6.1 Harris 苏木精的配制:苏示精 1g、硫酸铝钾 15g、无水乙醇 10ml、蒸馏水 200ml 先用 蒸馏水加热溶解硫酸铝钾,用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中, 煮沸 1 分钟后,稍冷却,慢慢加入红色氧化汞 0.5g。继续加热至浆夜变为紫红色。用纱 布盖瓶口,用前滤纸过滤后每 100ml 加冰醋酸 5ml。 6.2 乙醇性伊红液 Y 的配制:伊红 Y0.5g、90%酒精 100ml 先将伊红溶于酒精,用玻棒研 3 碎溶解后,每 100ml 加冰醋酸 1 滴。 6.3 盐酸酒精分化液的配制:浓盐酸 0.51ml、75%酒精 99ml。 6.4 LFB
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- 髓鞘 胶质 细胞 糖蛋白 MOG 抗原 免疫原性 验证
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