中国药科大学.doc
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1、中国药科大学本 科 毕 业 论 文论文题目 RPE65蛋白质的结构预测 英文题目 Structure Prediction of the RPE65 Protein 专 业 海洋药学 院 部 生命科学与技术学院 学 号 0643522 姓 名 王婧 指导教师 郭城(研究生)方慧生教授 陈凯先(院士)课 题完成场所 中国药科大学江宁校区生物信息学教研室 论文工作时间: 2010 年 3 月 至 2010 年 6 月RPE65蛋白质的结构预测目录摘要 1前言 2第一章 背景介绍3生物信息学在蛋白质结构预测中的应用 3第二章 RPE65基因蛋白概述 62.1 RPE65基因蛋白的功能62.2 RPE
2、65蛋白质基因的组成6第三章 RPE65的3D结构模型预测 93.1 3D-PSSM获得RPE65的初步模型信息 93.2 SCWRL软件预测侧链坐标 103.3 Jackal软件包对模型的修饰12第四章 结果和讨论 14第五章 视网膜色素变性研究进展 18参考文献20致谢21RPE65蛋白质的结构预测0643522 王婧摘要:应用生物信息学的方法对蛋白质结构的预测,为进一步研究蛋白质的生物学功能开辟了一个新的领域。本课题的提出是通过生物信息学软件预测RPE65蛋白质的三级结构,并根据获得的三维结构模型,对其蛋白质功能的可能机制进行讨论,进而为设计新的蛋白质或改造已有蛋白质提供可靠的依据。 关
3、键词:蛋白质结构预测,视网膜,RPE65Structure Prediction of the RPE65 ProteinAbstract:Using bioinformatics methods for protein structure prediction opens a new area for further study of protein biological function. The topic proposed by bioinformatics method to predict the natural conformation of RPE65 and its stru
4、ctures, according to obtained three-dimensional structure model of the protein to discuss its function and possible mechanisms. This method also provides a reliable basis for designing new proteins and modified proteins.Keywords:protein structure prediction; retina; RPE65前言视紫红质是感光细胞中的一种视色素,在光线的接收和视觉
5、电位的产生方面具有重要的生理作用,由视紫红质介导的过度光信号传导是光性视网膜变性的主要原因。近年的研究表明,视网膜色素上皮细胞中的RPE65蛋白作为影响视紫红质再生的关键因素,与视网膜光损伤的易感性密切相关1。随着近年来生物信息学的快速发展,我们在该课题中应用生物信息学的研究方法对RPE65蛋白质的结构进行预测。生物信息学的一项重要研究是从蛋白质的氨基酸序列预测蛋白质结构。它的重点研究问题包括:有效建立“低同源性蛋白质比对方法”,为大部分蛋白质天然构象能够得到准确预测提供有效的基础方法;在从头预测方法中,建立较为准确的力场和有效的构象搜索算法,达到准确快速预测目的;建立准确有效地判断蛋白质天然
6、构象预测模型质量的方法。可见通过生物信息学的方法对蛋白质结构的预测,为进一步研究蛋白质的生物学功能开辟了一个新的领域。所谓的蛋白质结构预测就是如何从蛋白质的氨基酸序列预测出其空间结构。由于蛋白质的生物学功能在很大程度上依赖于其空间结构, 因此进行蛋白质的结构预测对了解未知蛋白生物学功能具有重要意义。本课题即是通过计算机在Linux系统下获得RPE65蛋白质基因的三维立体结构模型,进而讨论它在视觉周期中所发挥的重要作用。课题所介绍的计算机模型的研究,其主要过程是通过3D-PSSM服务器获取RPE65基因蛋白的初步三维结构模型,其相应的侧链是从SCWRL中获得。最后,应用Jackal与Charmm
7、力场对初步模型进行修复和完善。根据获得的三维结构模型,对蛋白质功能的可能机制进行讨论。并了解该蛋白质的生物学功能,进而为设计新的蛋白质或改造已有蛋白质提供可靠的依据,同时为新的药物分子设计提供合理的靶分子结构。第一章 背景介绍生物信息学在蛋白质结构预测中的应用目前,生物信息学主要是以计算机为工具对生物信息进行储存、检索和分析,并从中归纳总结出生物系统的规律,是当今生命科学和自然科学的重大前沿领域之一,同时也是21世纪自然科学的核心领域之一。其研究包括了基因组学、蛋白质组学、系统生物学、比较基因组学,重点主要体现在基因组学(Genomics)和蛋白质组学(Proteomics)两方面,具体说就是
8、从核酸和蛋白质序列出发,分析序列中表达的结构功能的生物信息。自1989年在美国举办生物化学系统论与生物数学的计算机模型国际会议,生物信息学已经发展到了计算生物学、计算系统生物学的时代。生物信息学的目标包括:1)组织由实验中获取的大量有关生物学的数据即建立相应的数据库,如PDB,Genbank,SwissProt等;2)方法学的研究建立分析这些数据的方法,如FASTA,PSI-BLAST,基因的确定,蛋白质结构预测等;3)应用这些方法分析相关的数据,提取对生物学工作者尤其是实验工作者关心的生物学信息。 生物信息学的重要研究课题有:大规模基因组测序中的信息分析;新基因和新SNP的发现与鉴定;非编码
9、区信息结构分析;遗传密码的起源和生物进化;完整基因组的比较研究;大规模基因功能表达谱的分析;生物大分子的结构模拟与药物设计;生物信息学分析方法的研究;建立国家生物医学数据库与服务系统等2。其中的生物大分子结构模拟与药物设计与我们的药学事业联系紧密,它改变了现代药学研究的模式,为21世纪药学专业的发展提供了强大的动力。随着人类基因组计划和相关测序技术的发展,如今人们已经获得了大量蛋白质的一级序列。然而要了解这些蛋白质功能的分子基础,只有氨基酸序列知识是不够的,必须要知道他们的三维结构(即空间构象)。与此同时,要设计药物也需要了解与药物相应的蛋白质受体的三维结构。这是摆在科学家面前的紧迫任务。当前
10、,虽然X射线晶体学技术、NMR、二维电子衍射等为蛋白质空间结构测定提供了有效的实验手段,但是这些方法提供蛋白质三维结构的速度还远小于蛋白质序列信息的增长速度。此外,这些方法还存在多种局限。此时,理论模拟与结构预测就显示了重要性2。 蛋白质结构预测问题就是如何从蛋白质的氨基酸序列出发预测它的功能构象问题。对蛋白质结构预测进行研究对基础理论和实际应用都有重大意义。在理论上,如果弄清楚蛋白质一级结构是如何决定其高级结构这个基本问题,将会使人们更系统和完整地理解生物信息从DNA 到具有生物活性蛋白质的传递全过程,使中心法则得到更完整的阐明,从而对生命过程中的各现象有进一步的深刻认识,最终推动生命科学的
11、快速发展。具体的讲,蛋白质结构预测的理论预测方法可分为三大类3,4:(1)同源建模法同源建模法(比较建模法)是基于知识的蛋白质结构预测方法。这一方法目前主要是指同源结构预测。它是在未知蛋白质中有同源结构可以参考的情况下应用的一种技术。它可以根据同源结构中保守的部分搭建出未知蛋白质的结构骨架。它是现在最为成熟的预测方法。蛋白质根据序列同源性可以分成不同的家族。一般认为序列同源性大于30%的蛋白质可能由同一祖先进化而来,称为同源蛋白质。同源蛋白质具有相似的结构和功能。所以利用结构已知的同源蛋白质可以建立目标蛋白质的结构模型,然后用理论计算方法进行优化。利用同源模建方法建立的蛋白质模型是以已知的同源
12、蛋白质结构为基础的,所以这是一种基于现代生物学知识的预测方法。同源模建的基本过程包括六部分:目标序列与模板序列的匹配;根据同源蛋白质的多重序列匹配结果,确定同源蛋白质的结构保守区以及相应的框架结构;目标蛋白质结构保守区的主链模建;目标蛋白质结构变异区的主链模建;侧链的安装和优化;对模建结构进行优化和评估。序列匹配对建立精确的结构模型起着关键作用。一般地,序列同源性越差,匹配的准确程度越低,建立的模型精度也越差;序列同源性低于30%的蛋白质难以得到理想的结构模型。传统的序列分30%的蛋白质难以得到理想的结构模型。(2)折叠识别法它可以应用到没有同源结构的情况中,且不需要预测二级结构,即可直接预测
13、三维结构,从而可以绕过现阶段二级结构预测准确性不超过65%的限度,因此是一种有潜力的预测方法。它的主要原理是把未知蛋白质的序列和已知的这种结构进行匹配,找出一种或几种匹配最好的结构作为未知蛋白质的预测结构。它的实现过程是总结出已知的独立的蛋白质结构模式作为未知结构进行匹配的模板,然后经过对现有的数据库的学习,总结出可以区分正误结构的平均势函数作为判别标准,来选择出最佳的匹配方式。它的局限性是假定的蛋白质折叠类型是有限的。所以只有未知蛋白质和已知蛋白质结构相像的时候,才有可能预测出未知的蛋白质结构。(3)从头预测法它要求方法本身可以指根据蛋白质的氨基酸序列来预测蛋白质的二级结构和高级结构,从理论
14、上讲是最为理想的方法。但现在所有的方法还不能完全达到这个要求。从头预测法又可细分为,二级结构预测、超二级结构预测、蛋白质结构类型预测、蛋白质折叠模式预测、详细的三维结构的直接预测等。从蛋白质序列预测空间结构是蛋白质结构预测的最终目标。然而这种方法一直受到两方面的困扰:首先,难以找到一个能严格区分蛋白质的天然构象和非天然构象的能量函数,使能量函数的全局极小点对应蛋白质天然结构。目前已有的能量函数都采用经验势函数;其次,由于蛋白质系统分子量和柔性都很大,所以在蛋白质的势能面上存在着极多的局部极小点,缺少一种有效的全局优化算法也制约着这种方法的发展。在利用分子力场建立能量函数的过程中,模型的准确性和
15、模型的简化是需要权衡的基本矛盾.然而,蛋白质的三维结构预测是蛋白质结构预测的最终目标。目前还没有一种预测方法能得到比较满意的结果。蛋白质的三维结构预测是根据二级结构预测的结果以及蛋白质结构类型和折叠类型预测的结果,考虑到结构间的立体化学性质,亲疏水性质,氢键以及静电相互作用,把可信度较高的二级结构进一步组装,搭建出最后的蛋白质空间结构。这种方法虽可构建出一些蛋白质结构,不过因为它依赖于前面的预测结果,所以受到的限制太多。另一个方向是不依赖二级结构预测的结果,直接预测三维结构的方法。在这个方向中最原始的方法是借用成功的应用小分子构象研究的分子动力学和分子热力学方法。对蛋白质整个构象空间进行搜索,
16、然后找出能量最低的构象作为最后的预测构象。由于这种方法的计算量非常大,所以这种方法已经不再应用到蛋白质结构的从头预测问题。这种方法的基本框架被继承下来。由于上述两种方法的局限性,无法单独完成预测工作,因而将其合并用来预测目标基因蛋白。在本课题的研究中,通过对基因蛋白的氨基酸序列的搜索,建立初步结构模型,再对其进行侧链的预测,获得完整的结构信息,最后利用分子力学完善初步结构,并取得最后的模型。第二章 RPE65基因蛋白概述2.1 RPE65基因蛋白的功能视网膜之所以能感受光线是由于其含有高度分化的感光细胞-视锥和视杆细胞,而关于视觉形成的化学机制研究源于在蛙眼感光细胞中发现了一种能够感光的色素-
17、感光色素,它是视网膜把光线刺激转化为神经冲动从而形成视觉冲动的物质基础。视细胞中的感光色素主要就是视紫红质( rhodop sin,RHO) 1。RPE65retinal pigment epithelial(cells) 65 kDa protein是视网膜色素上皮(retinal pigment epithelial,RPE)细胞内一个65kDa的蛋白质,是维生素A循环(retinoid cycle,RC),又称视循环(visual cycle,VC)中的异构酶。RPE位于视网膜最外层,具有吞噬感光细胞脱落盘膜、参与维生素A 在视网膜中的代谢、构成血-视网膜屏障等重要的生理功能。REP65
18、基因定位于1p31,该基因仅在RPE细胞中特异表达的蛋白RPE65。RPE65基因的功能是结合全反式视黄酯,并提供给isomerohydrolase(IMH),IMH可以异构化和水解11-顺式视黄醇。RPE65基因不仅可以结合全反式视黄酯,而且可以从细胞膜中提取酯,虽然它没有内在的催化能力,但也可以影响IMH的活动。1998年Redmond等发现RPE65是11-顺-视黄醇生成过程中所必需的蛋白质,是催化全反视黄醇( all-trans retinol) 转变成11-顺视黄醇( 11-cis retinol)的异构酶之一, 11-顺视黄醇再经过一系列代谢转变成视紫红质,继而参与光信号的传导过程
19、5。研究发现在某些啮齿动物模型中,视网膜光损伤的易感性( light damage suscep tibility, LDS) 是由其基因决定的,而RPE65在其中扮演了重要的角色6,7。2005年Redmond等证实RPE65即为视黄醇异构酶。但是由于RPE65的的孤立状态以及结晶困难,迄今为止它的具体结构和作用机制仍不明确。2.2 RPE65蛋白质基因的组成RPE65基因蛋白包含两种构型:sRPE65和mRPE65。sRPE65存在于细胞质中,具有可溶性,而mRPE65和细胞膜相关。两者在棕榈酰化的过程中,结构会发生变化:mRPE65有三个残基被棕榈酰化,并且是全反式视黄酯的分子伴侣,它结
20、合视黄酯后,提供给IMH,进入视觉周期并将其转化成视黄醛,但它本身没有催化能力。sRPE65具有低亲酯性,不能棕榈酰化,作为全反式视黄醇(维生素A)的分子伴侣,而不能和视黄酯相结合。因此,可以通过RPE65的棕榈酰化作用来选择性控制与何种配体的结合。而这两种蛋白通过卵磷脂视黄醇酰化转移酶(LRAT)可相互转化,从而使它们扮演分子开关的作用,如图(Fig.1)8。Fig. 1. The Mammalian Visual Cycle这里所提到的棕榈酰化是蛋白质翻译后脂质共价修饰的一种重要形式,对象主要是胞质蛋白质,棕榈酰化对蛋白质功能产生多重影响。棕榈酰基是十六碳脂肪酰基。膜蛋白的棕榈酰化修饰非常
21、普遍,它是在肽链合成完毕之后发生的。棕榈酰基的供体是棕榈酰辅酶A,受体是蛋白质分子中Cys残基。在酶的催化下,棕榈酰基通过一个硫酸酯键与底物蛋白质分子上的Cys残基共价结合,并通过疏水的酯酰基将蛋白质定位于质膜。例如视紫红质是I型跨膜蛋白,C端直胞质内,可通过两个S-棕榈酰基与膜结合。被修饰的Cys残基可以位于底物蛋白的N端附近(如鸟苷酸结合蛋白的G亚基),C端附近(如5-羟色胺受体)获跨膜结构附近(如抗利尿素受体),如图(Fig.2)9。但在被修饰的Cys残基附近未发现有保守序列。蛋白质的棕榈酰化修饰过程是可逆的。被棕榈酰化修饰的蛋白质大多数定位于膜上的整合蛋白,其中相当多为受体蛋白,它也能
22、调节蛋白质与膜,以及蛋白质与蛋白质的动态相互作用10。Fig. 2. The role of the palmitic acid molecules in the mRPE65 model. 综上,我们可以根据其相同的氨基酸序列和棕榈链的构象效应预测他们相似的结构和功能。在这项工作中,应用计算机方法预测mRPE65和sRPE65的蛋白质结构。由于mRPE65蛋白质结构和sRPE65几乎相同,因而当我们在描述蛋白质结构预测的是,使用RPE65基因蛋白表示他们两个。第三章 RPE65的3D结构模型预测在本课题的研究中,同源建模法和分子力学方法已被合并用来预测RPE65基因蛋白。由于上述两个方法无法
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