第一节蛋白质的结构.doc
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1、3 蛋白质的结构与功能 蛋白质译自Albuminoid,该词来自拉丁文Albumina(蛋白)。1838年,德国化学家Mulder建议采用Protein一词,立即得到瑞典著名化学家Berzelius的支持,逐渐被学术界普遍采用,该词源自希腊文,意为最原始、最基本、最重要的。可见,蛋白质自发现后一直受到化学家和生物学家的重视。因为蛋白质是活细胞中含量最丰富、功能最复杂的生物大分子,是各种生物功能主要的体现者。蛋白质是以核酸为模板合成的,是基因表达的主要产物,因此人们将核酸称为“遗传大分子”,而把蛋白质称为“功能大分子”。近50年来,以核酸-蛋白质的结构、功能及其相互关系为中心,逐渐形成了分子生物
2、学,成为带领生命科学进入新时代的龙头。 3.1 蛋白质的分子结构图3-1 蛋白质的结构层次 蛋白质是20种天然氨基酸缩合成的大分子,分子量从10kDa至数百kDa,有着极其复杂的结构。1952年,丹麦生物化学家Linderstrom-Lang把蛋白质的分子结构划分为几个不同的结构层次:一级结构(primary structure) 指多肽链中氨基酸残基的数目、组成及其排列顺序(N-端C-端),即由共价键维系的多肽链的二维(线性)结构,不涉及空间排列。二级结构(secondary structure)是多肽链主链(backbone)在氢键等次级键作用下折叠成的构象单元或局部空间结构,未考虑侧链的
3、构象和整个肽链的空间排布。1973年Rossman发现相邻的二级结构往往形成某种有规律的、空间上可辩认的、更高层次的折叠单元,称为超二级结构(super-secondary structure)或折叠单元(folding unit),主要涉及这些构象元件在空间上如何聚集。与此同时,Wetlaufer观察到蛋白质分子中存在相对稳定的球状亚结构,其间由单肽链相互连接,命名为结构域(stmctural domain)。三级结构(tertiary stmcture)则指整个肽链的氨基酸残基侧链基团互相作用以及与环境间的相互作用下形成的三维结构。1958年英国晶体学家Bernal发现寡聚蛋白由具有三级结
4、构的亚基在次级键作用下结合而成,遂把寡聚体内亚基的空间排列称为四级结构(quaternary structure)。图3-1展示蛋白质(主要指球状蛋白)分子结构的不同层次及其相互联系。3.1.1 蛋白质一级结构及其研究3.1.1 1 蛋白质的氨基酸 蛋白质的构件分子是20种氨基酸。20种-氨基酸是在蛋白质生物合成中,由mRNA指令依次参入,形成特定的多肽链。氨基酸除Gly外,其碳原子均属不对称碳原子,因而都具有光学活性,且均为L-型氨基酸。多肽链中氨基酸残基的侧链基团(R)各不相同,对多肽链的构象有很大影响。蛋白质中除了我们所学的20种常见氨基酸外, 1986年英国的chamber和德国的zi
5、noni等发现了硒半胱氨酸,并将它命名为第21个氨基酸。2002年5月,美国的srinivasan和Hao等报导发现了第22种天然氨基酸,即吡咯赖氨酸(pyrrolysine),硒半胱氨酸是由原来的终止密码子UGA编码的,吡咯赖氨酸则是由终止密码子UAG编码。自然选择导致了超出20种标准氨基酸的密码子的形成。这两种氨基酸编码的共同特点是(1)由传统意义的终止密码子编码,预示着终止密码子将可能被重新定义;(2)由特定酶的作用下形成各自的氨酰tRNA;(3)各自的氨酰tRNA都是在翻译的同时掺入到多肽链中的。3.1.1.2肽和肽键1、肽的概念及肽键的形成:肽是由多个氨基酸经肽键连接的聚合体;肽键是
6、由一个氨基酸的-羧基和下一个氨基酸的-氨基脱水形成的共价键。肽单位肽键图3-2 肽单位和肽键结构2、天然活性肽除了蛋白质水解可以产生长短不一的各种肽段之外,生物体还有很多活性肽游离存在。天然活性肽又称天然肽(Natural peptide),是生物体内一些具有特殊功能肽的总称,一般为寡肽和较小的肽。这类多肽通常都具有特殊的生理功能,如作为沟通细胞与细胞之间,器官与器官之间的重要信使;传递各种特异信息,使机体构成一系列严密的控制系统;调节生长、发育、繁殖、代谢和行为等生命过程。下面列举几个重要的天然活性态。谷胱苷肽谷胱苷肽(glutathione)是g-谷氨酰半胱氨酰甘氨酸构成的三肽(GSH),
7、广泛存在于动植物和微生物细胞中,其结构组成与大多数肽类不同,一是谷氨酸的羧基参与反应,形成了-肽键,二是谷胱苷肽的侧链含有SH。谷胱甘肽在体内参与氧化还原过程,作为某些氧化还原酶的辅因子,或保护巯基酶,在红细胞中作为巯基缓冲剂存在,维持血红蛋白和红细胞及其他蛋白质的半胱氨酸残基处于还原态,或防止过氧化物积累。短杆菌肽S短杆菌肽S(gramicidin S) 是1944年从短杆菌的培养液中获得的,由短杆菌所产生的一种由五种氨基酸组成的环状10肽抗菌素,分子中含有D-型氨基酸和非蛋白质氨基酸,对革兰氏阳性细菌有强大的抑制作用,对阴性细菌如绿脓杆菌,变形杆菌也有效,临床上局部用于治疗和预防化脓性病症
8、。 图3-3 短杆菌肽结构神经肽神经肽(nervonic peptide)首先是从 脑组织中分离出来的并主要存在于中枢神经系统的一类活性肽。神经肽包括有:脑啡肽,内啡肽,强啡肽等一系列脑肽。因为这些肽类都与痛觉有关,具有吗啡一样的镇痛作用,所以就把它们称作脑内产生的吗啡样肽(脑啡肽)或内源性吗啡样肽(内啡肽)。脑啡肽为5肽,以甲硫氨酸结尾的是甲硫氨酸脑啡肽,以亮氨酸结尾的为亮氨酸脑啡肽Tyr.Gly.Gly.Phe.Met 甲硫氨酸脑啡肽Tyr.Gly.Gly.Phe.Leu 亮氨酸脑啡肽 两者都具有镇痛作用,它们由同一前体267个残基的前脑啡肽原转变而来,是1975年英国人J.Hughes等
9、人从猪脑内发现并分离出来的。抗菌肽抗菌肽是一种抗菌素(antibiotic),是一类由特定微生物产生的,并含有非蛋白质氨基酸抑制细菌和其它微生物生长或繁殖的物质,对传染性疾病的治疗有重要意义。该类物质中最熟悉的是青霉素(penicillin)。青霉素的立体结构是由D-半胱氨酸和缬氨酸 以非肽键结合的二肽衍生物结构通式中有R基,R不同即为不同的青霉素,如R基为苯甲基是苄青霉素。青霉素的作用:破坏细菌细胞壁糖肽的合成,引起溶菌。3.1.1.3蛋白质一级结构的测定蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来,现在已经有上千种不同蛋白质的一级结
10、构被测定。 氨基酸顺序测定基本战略:将大化小,逐段分析,片段重迭,确定全序;图3-4 蛋白质顺序测定的步骤测定的基本步骤:纯化蛋白质、拆开二硫键、末端氨基酸测定、专一性裂解、将肽段分离并测出顺序、将肽段序列进行叠联以确定完整的顺序。如图3-4所示。下面讨论几个主要的测定步骤。下面讨论几个主要的测定步骤。 (1)多肽链的拆分由多条多肽链组成的蛋白质分子,必须先进行拆分成多肽链(亚基)。如,血红蛋白为四聚体,烯醇化酶为二聚体。如果肽链间以共价键连接时:即二硫键或链间二硫键,必须先将二硫键打开。用下列氧化还原法。图3-5 b-巯基乙醇还原二硫键A:b-巯基乙醇还原二硫键;B:二硫苏糖醇还原二硫键:然
11、后用碘乙酸保护还原生成的半胱氨酸的巯基,以防它重新氧化。二硫苏糖醇生成环化物;C:用过甲酸处理,使二硫键氧化成磺酸基而将链分开。二硫键拆开后形成的单个肽链,可用纸层析、离子交换层析或电泳等方法进行分离。肽链间以非共价键连接时,用酸、碱、高浓度的中性盐或变性剂(如8mol/L脲、6mol/L盐酸胍)处理,将肽链分开。(2)测定蛋白质分子中多肽链的数目:通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系,即可确定多肽链的数目。 (3) 多肽N、C末端氨基酸的测定: A 、N端 在肽链氨基酸顺序分析中,最重要的是N-端氨基酸分析法,主要有下列几种反应方式:Sanger法(2、4-二硝基氟苯反应)
12、:氨基酸与2、4一二硝基氟苯(DNFB)的反应,2、4二硝基氟苯与N-末端的氨基酸反应后生成DNP多肽或DNP-蛋白质。由于DNFB与氨基形成的键对酸水解远比肽键稳定,因此DNP-多肽经酸水解后,只有N-末端氨基酸为黄色DNP-氨基酸衍生物,其余的都是游离氨基酸。只要鉴别所生成的DNP-氨基酸,便可得知多肽链的N-端氨基酸。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。图3-6 sanger反应图3-7 丹磺酰氯(dansyl chlorid) 末端分析(DNS法)氨基酸混合物氨基酸混合物DNS法(丹磺酰氯末端分析法):丹磺酰氯(dansyl chlorid)是二甲氨基萘磺酰氯的简称。此方法的原理
13、与DNFB法相同,只是用DNS代替了DNFB试剂。由于丹磺酰氯具有强烈的荧光,灵敏度比DNFB法高100倍,并且水解后的DNS-氨基酸不需要提取,可直接用纸电泳或薄层层析加以鉴定 。图3-8 艾德曼反应苯异硫氰酸酯法(Edman reaction):多肽或蛋白质末端氨基也和氨基酸的-氨基一样与PTTC(Edman试剂)作用,生成苯氨基硫甲酰多肽或蛋白质,简称PTC-多肽或蛋白质。后者在酸性有机溶剂中加热时,N-末端的PTC-氨基酸发生环化,生成苯乙内酰硫脲的衍生物并从肽链上掉下来,除去N-末端氨基酸后剩下的肽链仍然是完整的,因为PTC基的引入只使第一个肽键的稳定性降低。反应液中代表N-末端的P
14、TH-氨基酸,经有机溶剂抽提干燥后,可用薄层层析、气相色谱和高效液相色谱等进行鉴定。此法的特点是能够不断重复循环,将肽链N-端氨基酸残基逐一进行标记和解离。 氨肽酶法:氨肽酶法是一类肽链外切酶,能从多肽链的N端逐个切下,根据不同的反应时间测出酶水解所释放的AA种类和数量,按反应时间和残基释放量作动力学曲线,就能知道该蛋白质的N端残基顺序。 B 、C端 肼解法:蛋白质或多肽与无水肼加热发生肼解,C-端氨基酸即从肽链上解离出来,反应中除C末端氨基酸以游离形式存在外,其它的AA都转变为相应AA酰肼化合物,再与甲醛作用变为水不溶的二苯基衍生物而沉淀,上清中游离的C端AA借助FDNB法进行鉴定。还原法:
15、肽链C末端氨基酸用硼氢化锂还原成相应的 氨基醇,用层析法鉴定 氨基醇即可得知C末端的AA。羧肽酶法:羧肽酶是一种肽链外切酶,它能从多肽链的C-端逐个的水解。根基不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量,从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。目前常用的羧肽酶有四种:A,B,C和Y;A和B来自胰脏;C来自柑桔叶;Y来自面包酵母。羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基;B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。用羧肽酶水解多肽链的C末端AA,再用层析法鉴定AA。(4)多肽链的部分裂解:可选用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片,并将其分
16、离出来。酶解法: A胰蛋白酶:主要作用于肽链中碱性氨基酸羧基端肽键。B胃蛋白酶:专一性水解酸性氨基酸及芳香族AA羧基肽键;C弹性蛋白酶:作用于脂肪族AA的羧基端肽键。D胰凝乳蛋白酶:主要作用于肽链中碱性氨基酸羧基端肽键。化学法:如溴化氰法,溴化氰断裂法,专一性裂解甲硫氨酸的羧基肽键 ,切点少,片段大。 (5)肽段在多肽链中次序的确定例如:某蛋白质肽链的一个10肽片段,用两种水解酶进行水解,水解方法A得到四个小片段,分别为: A1 Ala-Phe; A2 Gly-Lys-Asn-Tyr; A3 Arg-Tyr; A4 His-Val.水解方法B得到三个小片段,分别为: B1:Ala-Phe-Gl
17、y-Lys; B2: Asn-Tyr-Arg; B3: Tyr-His-Val重叠结构拚组为: A1;Ala-Phe B1:Ala-Phe-Gly-Lys A2: Gly-Lys-Asn-Tyr; B2: Asn-Tyr-Arg A3: Arg-Tyr; B3 Tyr-His-Val. A4: His-Val. 10肽顺序:Ala-Phe-Gly-Lys-Asn-Tyr-Arg-Tyr -His-Val。两种以上方法专一性地裂解成两套以上肽段;分别将肽段纯化;测出其AA顺序;片段重叠法拼凑出整条多肽链AA顺序。(6)确定多肽链中的二硫键位置:如果蛋白质分子中存在链间或链内二硫键,则在完成多肽链
18、的氨基酸序列分析以后,需要对二硫键的位置加以确定,这是因为在测定多肽链的氨基酸序列时,首先需要把蛋白质分子中的全部二硫键拆开。确定二硫键的位置一般采用胃蛋白酶水解原来的含二硫键的蛋白质。选用胃蛋白酶水解是因为它的专一性比较低,切点多,这样生成的 肽段包括含有二硫键的肽段都比较小,对后面的分离、鉴定比较容易,其次是因为胃蛋白酶作用的pH在酸性范围(2),有利于防止二硫键发生交换反应而造成的麻烦。所得的肽段混合物利用对角线电泳进行分离。对角线电泳是把水解后的混合肽点到滤纸的中央,在PH6.5的条件下,进行第一向电泳,肽 段将按其大小及电荷的不同分离开来。然后图3-9 磺基丙氨酸的生成把滤纸暴露在过
19、甲酸蒸汽中,使S-S断裂,这时每个 含二硫键的肽段 被氧化成一对含磺基丙氨酸的肽(如图3-9),滤纸旋转900角再与第一向完全相同的条件下进行第二向电泳。在这里大多数肽段的迁移率未变,并将位于滤纸的一条对角线上,而含磺基丙氨酸的成对肽段比原来含二硫键的肽小而负电荷增加,结果它们都偏离了对角线,肽斑点可用茚三酮显色确定。将每对含磺基丙氨酸的肽段(未用茚三酮显色的)分别取下,进行氨基酸序列分析,然后与多肽链的氨基酸序列比较,即可推断出二硫键在肽段链间或链内的位置。图3-9 磺基丙氨酸的生成3.1.1.3 蛋白质一级结构研究进展 蛋白质的一级结构即多肽链中氨基酸残基的排列顺序(N-端一C-端)是由基
20、因编码的,是蛋白质高级结构的基础,因此一级结构的测定成为十分重要的基础研究。19451955年,英国生物化学家Sanger率先完成了人胰岛素的序列测定。1950年,瑞典科学家Edman发明了以他的名字命名的N-端测定法,并与Begg在1967年发明了序列仪,极大地推动了蛋白质一级结构的测定工作。尽管如此,蛋白质一级结构测定仍是一项相当耗费时间和资金的工作。因而测序方法和技术的改进与创新势在必行。主要进展包括以下几方面: (1)Edman降解试剂和方法的改进 Edman最初使用异硫氰酸苯酯,在许多方面已不能满足测定需要,因此要求进一步提高Edman降解试剂的专一性,并使降解产物(氨基酸衍生物)易
21、于鉴定和提高检测灵敏度。如采用4-N,N-二甲基氨基偶氮苯-异硫氰酸酯/异硫氰酸苯酯双偶合法,可将测定精度提高12个数量级。同位素标记的降解试剂可用于1012mol的肽测序。 (2)序列仪的改进与创新 早期的液相序列仪样品和试剂用量大,一次只能连续测定2040个残基。1980年代中期以来,发展并改良的固相法采用PVDF膜,与待测蛋白的C-端偶联,样品用量减至110nmol,一次可连续测定60个残基。同时问世的气相测序仪灵敏度高,样品用量最少为5pmol,溶剂和试剂消耗为液相序列仪的10,而且检测速度快。 (3)质谱法在蛋白质测序中的应用 质谱法特别适用于小肽测序,质谱汽相色谱联用仪自动化水平高
22、,数秒钟即可完成10个氨基酸的小肽测序。由于把场致解吸附、等离子非吸附、离子喷射、快速电子冲击等技术引入质谱法,可省去测序中最耗时的分肽程序。 (4)核酸测序与蛋白质测序有机结合,相互印证,仍是当前的最佳选择。据截止1997年底的统计,主要的蛋白质序列数据库SWISS-PROT已收入69000个蛋白的序列,其中绝大数是根据cDNA或DNA序列推测的。3.1.2蛋白质特定构象形成的原因和驱动力1多肽链折叠的空间限制(1)肽键的双键性质:Pauling利用-射线技术研究蛋白质肽键结构时,发现肽键是一个平面结构,Pauling(1945年)和Momany(1975年)先后测定了肽键的基本数据,由于反
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