苏州大学微生物制药复习纲要.doc
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1、苏大08生物制药 微生物制药复习纲要感谢李倩,马一丹,蔡婷同学的合作整理,有不足的请大家修正。第二章:微生物药物产生菌和菌种改良1、自发突变的原因:菌种连续传代,这种自发突变比保藏过程中产生的比例高,因为在生命活动中遗传物质更容易受环境因素的影响。活细胞内进行的新陈代谢活动,能产生具有诱变作用的物质,如过氧化氢、有机过氧化物等,当它们在细胞内积累到一定浓度时能诱发DNA结构的改变。DNA中存在的增变基因也能诱发基因突变.有的微生物染色体上还存在导致菌体退化的死亡基因,DNA的代谢失调也会引起基因突变而造成菌种退化。2、自然选育:是一种纯种选育方法.它利用微生物在一定条件下产生自发突变的原理,通
2、过分离、筛选排除衰退型菌株,从中选择维持原有生产水平的菌株。因此,它能达到纯化、复壮菌种,稳定生产的目的,生产上又将该方法称为自然分离。3、单孢子悬浮液的制备:用无菌生理盐水或缓冲液制备单孢子悬浮液,在显微镜下计数,也可稀释后在平板上进行活菌计数。4、诱变育种:通过诱变剂处理就可以大大提高菌种的突变频率,扩大变异幅度,从中选出具有优良特性的变异菌株,这种方法就称为诱变育种。5、诱变育种的特点:优点:速度快、收效大,方法简便,是当前菌种选育的主要方法,生产中使用十分普遍。缺点:诱发突变缺乏定向性,因此诱发突变必须与大规模的筛选工作配合才有好的效果。6、DNA损伤的修复:不利于突变发生光复活作用切
3、补修复DNA多聚酶的校正作用 利于突变发生SOS修复系统重组修复。6-1光复活作用:DNA被紫外线照射后形成胸腺嘧啶二聚体,黑暗中酶与二聚体结合,形成的复合物在可见光照射下,酶可以解离二聚体,DNA复原。6-2切补修复:在4种酶的协同作用下进行DNA损伤的修复,4种酶都不需要可见光的激活:在胸腺嘧啶二聚体的5端,核酸内切酶作用下造成单链断裂;其次在核酸外切酶作用下切除胸腺嘧啶二聚体;然后在DNA多聚酶、的作用下进行修补合成,最后在DNA连接酶的作用下形成一个完整的双链结构。6-3 DNA多聚酶的校正作用:细胞对于复制过程中的差错也具有校正功能。大肠杆菌中的三种DNA多聚酶(多聚酶、)也具有3到
4、5外切酶的作用,能在复制过程中随时切除错配的核苷酸。6-4 SOS修复系统:一种能够造成误差修复的“呼救信号”修复系统。当DNA受诱变损伤而阻断DNA复制时,DNA损伤相当于一个呼救信号,促使细胞中的有关酶系解除阻遏,进行DNA修复。修复过程中,DNA多聚酶在无模板的情况下进行DNA的修复合成,并将合成的DNA片段插入受损DNA的空隙处。SOS修复系统容易导致基因突变,大多数经诱变所获得的突变来源于此修复系统的作用。6-5重组修复:重组修复必须在DNA进行复制的情况下进行,又称为复制后修复。重组修复是在不切除胸腺嘧啶二聚体的情况下进行修复作用。以带有二聚体的单链为模板合成互补单链,但在每一个二
5、聚体附近留下一个空隙,通过染色体交换,空隙部位不再面对二聚体,而是面对正常单链,此时DNA多聚酶和连接酶能把空隙部分修复好。7、前突变:诱变剂所造成的DNA分子的某一位置的结构改变称为前突变。例如紫外线照射形成的胸腺嘧啶二聚体就是一种前突变。8、突变:前突变可以通过影响DNA复制而成为真正的突变。也可以经过修复重新回到原有的结构而不发生突变。9表型延迟的原因:分离性迟延:分离性迟延是经诱变处理后,细胞中的基因处于不纯的状态(野生型基因和突变型基因并存在同一细胞中),突变型基因由于属于隐性基因而暂时得不到表达,需要经过复制、分离,在细胞中处于纯的状态(一细胞中只有突变型基因,没有野生型基因)时,
6、其性状才得以表达。生理性迟延:突变基因由杂合状态变为纯合状态时,还不一定出现突变表型,新的表型必须等到原有基因产物稀释到某一程度后才能表现出来。而这些原有基因产物浓度降低到能改变表型的临界水平以前,细胞已经分裂多次,经过了好几个世代。10反馈抑制(feedback inhibition):是指代谢途径的终产物对催化该途径中的一个反应(通常是第一个反应)的酶活力的抑制,其实质是终产物结合到酶的变构部位,从而干扰酶和它底物的结合,当然与此相反为酶活性的激活。11反馈阻遏(feedback repression):是指终产物(或终产物的结构类似物)阻止催化该途径的一个或几个反应中的一个或几个酶的合成
7、,其实质是调节基因的作用,这是微生物不通过基因突变而适应于环境改变的一种措施,当然与此相反有酶合成的诱导。12筛选终产物营养缺陷型例1筛选终产物营养缺陷型例1ABCDEabcd例1 在简单的代谢途径中累积代谢产物在一原始菌株中,其终点产物E反馈抑制第一个酶,并反馈阻遏第一个和第二个酶。获得了缺少第三个酶的突变株,需要供给E才生长。如果供给限量的E,就可打破反馈调节,产生大量的C需要的发酵产物13渗漏缺陷型:遗传性障碍不完全的营养缺陷型,突变使某一种酶的活性下降而不完全丧失,这种缺陷型能够少量地合成某一代谢物,能在基本培养基上少量生长。渗漏缺陷型不会合成过多的终产物,所以不会造成反馈调节而影响中
8、间产物的积累。多数抗生素高产菌株生长速度低于野生菌株,似乎在某种意义上是渗漏缺陷型。生长速率低有利于抗生素的合成。筛选终产物营养缺陷型例2ABCKJMLNj1j2例2 在一分支途径中,中间产物的大量积累在原始菌株中,终点产物L反馈抑制a酶和j1酶,并反馈阻遏a酶,终点产物N反馈抑制和阻遏a酶和j2酶。L和N对a酶有累加反馈效应。已获得一个缺少j1酶的突变株,它生长需要L。如以限制生长的浓度供给L时,可打破L的反馈调节,导致J的大量积累。此图代表产氨杆菌的一个腺嘌呤缺陷型的肌苷酸的大量生成a天门冬氨酸异亮氨酸14筛选终产物营养缺陷型例3天门冬氨酰磷酸天门冬氨酸半醛赖氨酸高丝氨酸苏氨酸蛋氨酸天门冬
9、氨酸激酶双氢吡啶二羧酸合成酶高丝氨酸脱氢酶赖氨酸的大量合成在谷氨酸棒杆菌的原始菌株中,赖氨酸和苏氨酸合作反馈抑制天门冬氨酸激酶,获得一个缺少高丝氨酸脱氢酶的突变株。它的生长需要苏氨酸和蛋氨酸。如果苏氨酸以限制生长的浓度加入时,合作反馈抑制被打破而大量产生赖氨酸。15细胞膜透性改变的突变株原理:细胞膜透性改变,大量初级代谢产物被分泌到细胞外,细胞内浓度降低,避免终产物反馈调节。例如谷氨酸棒杆菌的生物素营养缺陷型进行谷氨酸发酵,生物素是合成脂肪酸必须的,脂肪酸是组成细胞膜类脂的必要成分。该缺陷型在生物素处于限量的情况下,不利于脂肪酸的合成,使细胞膜的透性发生变化,利于谷氨酸分泌至体外的发酵液中。油
10、酸缺陷型或甘油缺陷型在生物素过量的条件下谷氨酸也在体外大量积累。16筛选结构类似物(抗代谢物)抗性突变株由于结构类似物没有正常生理功能,细胞缺乏该代谢物,生长受抑制甚至死亡生存下来的菌株即为抗反馈调节突变株结构类似物产生反馈调节,阻碍该代谢物生成在培养基中加入大量与代谢产物结构类似的化合物17次级代谢:某些微生物为了避免在初级代谢过程中某些中间产物积累所造成的不利作用而产生的一类有利于生存的代谢类型。18次级代谢的特点:1、次级代谢物不是菌生长、繁殖必需的; 2、次级代谢又受到初级代谢的调节,它们有一些共同的中间产物,这些中间产物可以合成初级代谢物也可以合成次级代谢物,取决于菌的遗传特性和生理
11、状态。(微生物的代谢系统倾向于平衡利用营养物质,可将过剩的营养物质转变为与生长繁殖无关的次级代谢物)。19筛选渗漏缺陷型:遗传性障碍不完全的营养缺陷型,突变使某一种酶的活性下降而不完全丧失,这种缺陷型能够少量地合成某一代谢物,能在基本培养基上少量生长。渗漏缺陷型不会合成过多的终产物,所以不会造成反馈调节而影响中间产物的积累。多数抗生素高产菌株生长速度低于野生菌株,似乎在某种意义上是渗漏缺陷型。生长速率低有利于抗生素的合成。方法:把营养缺陷型接种在基本培养基上,长出的菌落是回复突变株,长得特别小的菌落是渗漏缺陷型。20、碳源的抑制作用:能被菌快速利用的碳源在被快速分解利用时,往往对许多其他代谢途
12、径中的酶(包括抗生素合成酶和其他的酶)有阻遏或抑制作用,限制抗生素的发酵产量,不利于发酵工艺的控制。因此筛选去除碳源分解代谢调节突变株对于提高抗生素产量很有意义。21杂交育种的目的:通过杂交使不同菌株的遗传物质进行交换和重新组合,从而改变原有菌株的遗传物质基础,获得杂种菌株(重组体)可以通过杂交把不同菌株的优良生产性能集中于重组体中,克服长期用诱变剂处理造成的菌株生活力下降等缺陷通过杂交可以扩大变异范围,改变产品的质量和产量,甚至出现新的品种分析杂交结果,可以总结遗传物质的转移和传递规律,促进遗传学理论的发展22异核现象:营养缺陷型的放线菌,经菌丝间的接触核融合形成异核体,其基因型分别与亲本之
13、一相同,但形成的菌落在表型上是原养型的(即相应的野生型)。 异核体定义:同一条菌丝或细胞中含有不同基因型的细胞核23 接合现象:形成异核体后,相同细胞质里不同基因型的细胞核在双方增殖中,发生部分染色体的转移或遗传信息的交换。第三章:微生物产生菌的保藏1菌种保藏的目的:存活,不丢失,不污染;防止优良性状丧失;随时为生产、科研提供优良菌种。没有优良的菌种,就没有先进的微生物学。一个国家对菌种的收集、保藏和供应,反应了这个国家的水平。2菌种保藏的原理:选用优良的纯种,(最好是休眠体,如分生孢子、芽胞等),创造降低微生物代谢活动强度,生长繁殖受抑制,难以发生突变的环境条件。(其环境要素是干燥、低温、缺
14、氧、缺营养 以及添加保护剂等),使微生物暂时保持休眠状态,保持其优良的生产性能,尽可能减低其变异率。3.移植培养(传代培养)保藏法:一种基本的简易保存方法,实验室或工厂中必不可少的一种经典方法,适于所有微生物,关键是根据微生物的特点选择最适宜的培养基。4.液体石蜡保藏法5.砂土保藏法6.冷冻干燥保藏法(真空冷冻):简介:冷冻干燥法是在低温下快速将细胞冻结,然后在真空条件下干燥,使微生物的生长和酶活动停止。为了防止在冷冻和水分升华过程中对细胞的损害,要采用保护剂来制备细胞悬液,使细菌在冻结和脱水过程中起到保护作用的溶质,通过氢键和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型。7保护剂的选择
15、及制备:保护剂的作用是使细胞在冻干过程中免于死亡或损伤,并减少在保藏过程中的死亡,还能防止复水时引起的死亡,并使菌体容易从休眠状态恢复为生长发育状态。保护剂是保护性溶质,通过氢键和离子键对水和细胞所产生的亲和力来稳定细胞成分的构型,如保护剂可替代结合水而稳定细胞的构型,减少对细胞透性的破坏。选择对细胞和水有很强亲和力的保护剂,可防止因深冻和水分不断升华对细胞的损伤。对某些微生物,加保护剂反而有害,应特别注意。8冷冻干燥过程中的影响因素:1)菌的质量 2)保护剂 3)干燥速度 4)空气的影响 (5)温度的影响 (6)含水量的影响 (7)复苏培养 9冰冻损伤的机理:细胞内降温速度太快易形成冰晶,不
16、适当的复温易重结晶。溶质损伤冷冻使电解质和溶质的浓度逐步提高,对细胞膜造成压力而损伤细胞。冷冻也可使所有结构失去结构水而致死。细胞冷冻损伤主要是细胞脱水和细胞内结冰两个物理现象的平衡。当细胞外结冰时,细胞不断脱水,造成脱水细胞内电解质浓度提高,使渗透压发生变化,引起质壁分离,严重时膜的脂肪内脂质变性破坏细胞膜,致使细胞死亡。保护剂甘油、DMSO等可以吸住水分子,保护细胞膜不致大量脱水,可改善冷冻损伤程度。慢速解冻易重结晶,快速解冻能减少冷冻损伤。10菌种退化的定义:菌种经过多次传代或长期保藏后,由于自然突变或异核体和多倍体的分离,使有些细胞的遗传性状发生改变,造成菌种不纯,严重者使生产能力下降
17、,称为菌种退化。退化是在多次接种传代中逐渐发展的过程。11菌种退化的原因:1、自发突变与回复突变2、链霉菌遗传不稳定性:发生大幅度的DNA重建(扩增、缺失、转位)3、细胞本身自我调节和修复:有些DNA修复途径易发生突变4、环境条件的影响:温度、湿度、pH、通气条件等12复壮定义:使衰退的菌种恢复原来优良性状。狭义的复壮是指在菌种已发生衰退的情况下,通过纯种分离和生产性能测定等方法,从衰退的群体中找出未衰退的个体,以达到恢复该菌原有典型性状的措施;广义的复壮是指在菌种的生产性能未衰退前就有意识的经常、进行纯种的分离和生产性能测定工作,以期菌种的生产性能逐步提高。实际上是利用自发突变(正变)不断地
18、从生产中选种第四章 微生物药物的生物合成1 初级代谢:能使营养物质转变成机体的结构物质和对机体具有生理活性作用的物质,或是为机体生长提供能量的一类代谢。次级代谢:指存在于某些生物中(如某些植物和微生物),并在一定生长期内出现的一类代谢类型。其代谢产物在抵抗恶劣环境、伪装躲避、清除自身毒素和排泄物,寻找配偶以及在传递信息时都显得非常重要。2 初级代谢与次级代谢的区别? 存在范围及产物类型不同。不同的微生物可产生不同的初级代谢产物。 对产生着自身的重要性不同。初级代谢产物是机体必不可少的,次级代谢重要性低。 同微生物生长过程中的关系明显不同。初级代谢贯穿微生物生长全程,而次级代谢则是在一定时期内。
19、 对环境条件的敏感性或遗传稳定上明显不同。初级代谢敏感性小,遗传稳定性大,次级代谢相反。 某些机体内存在的两种既有联系又有区别的代谢类型。3 微生物初级代谢与次级代谢的关系?次级代谢产物的合成途径并不是独立存在的,而是与初级代谢产物合成途径间存在紧密联系,基本上都是以初级代谢产物为母体衍生而来,催化特殊次级代谢产物合成反应的酶可以从那些初级代谢途径的酶演化而来。初级代谢的关键性中间产物往往是次级代谢的前体,比如糖降解过程中的乙酰-CoA是合成四环素、红霉素的前体,乙酰-CoA 合成脂肪酸是初级代谢产物途径,经过重复缩合、环化或闭环等反应生成抗生素是次级代谢途径。4生源(biogen):次级代谢
20、产物中的构建单位。主要包括聚酮体、糖类、不常见氨基酸、非核酸的嘌呤碱和嘧啶碱、吩恶嗪酮、莽草酸、甲羟戊酸。5碳代谢物对次级代谢生物合成的调节?一般情况下,凡是能被微生物快速利用、促进产生菌快速生长的碳源,对次级代谢产物生物合成都表现出抑制作用(葡萄糖效应),这是由于速效碳源(如葡萄糖、柠檬酸等)的分解产物阻遏了次级代谢过程中酶系的合成,只有当这类碳源耗尽时,才能解除其对参与次级代谢的酶的阻遏,菌体才能转入次级代谢产物的合成阶段。6 氮源抑制次级代谢产物的机制?谷胺酸合成酶(GS)活力受铵根离子浓度调控,铵根离子浓度越高,GS活力越低,抗生素的合成能力也越低。 但硝酸盐能促进利福霉素的合成,原因
21、:1、硝酸盐可促进糖代谢和TCA循环中的酶活力以及琥珀酰CoA转化为甲基丙二酰CoA的酶活力;2、硝酸盐抑制丙氨酸脱氢酶(ADH)活力,从而抑制脂肪酸合成,使脂肪酸合成前体乙酰CoA转化为利福霉素脂肪环的前体;3、硝酸盐促进GS的活力,增加利福霉素前体浓度。7 磷酸盐对次级代谢生物合成的调节作用机制? 促进初级代谢,抑制次级代谢:通过次级初级代谢中的很多酶来促进初级代谢,提供大量初级代谢中间产物满足微生物快速生长需要,通过竞争初级代谢与次级代谢共同的中间体来抑制次级代谢; 抑制次级代谢产物前体的形成:通过抑制参与次级代谢产物前体合成的酶的活性,抑制次级代谢产物前体的形成,影响次级代谢途径。如链
22、霉素的前体肌醇由6-磷酸-葡萄糖环化酶催化形成,磷酸盐能增加对环化酶有竞争性抑制作用的焦磷酸的合成,使肌醇合成受抑制而影响链霉素合成。 阻遏次级代谢产物合成中某些关键酶的合成:如泰乐菌素结构中氨基糖合成中的一些关键酶,如脱水酶、氧化还原酶和转甲基酶都受到磷酸盐的阻遏。 抑制次级代谢产物合成中某些关键酶的活性:链霉素合成的最后一个中间体是链霉素磷酸酯,必须经碱性磷酸酯酶的作用脱去磷酸根才能生成链霉素,过量的磷酸盐抑制了该酶的活性,使该反应不能顺利进行,导致无活性的链霉素磷酸酯的积累,抑制了具有抗菌活性的链霉素的合成。 增加菌体能荷状态,促进新陈代谢:高产的次级代谢产物产生菌体内的ATP浓度比低产
23、菌株低,细胞内ATP水平手培养基中磷酸盐浓度调控,培养基中加入过量磷酸盐可大大提高ATP浓度,降低次级代谢产物的合成。如合成杀假丝菌素的灰色链霉菌培养液中添加磷酸盐,产生菌对氧的需要量增加,细胞内ATP浓度增大,抗生素合成停止。8 ATP对次级代谢生物合成的调节?ATP直接影响次级代谢产物合成和糖代谢中某些酶的活性。以磷酸烯醇式丙酮酸合成四环素为例,ATP抑制了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶,在第一步抑制了四环素的合成。9 酶的诱导对次级代谢产物生物合成的调节?诱导(induction):是酶促分解底物或产物诱使微生物细胞合成分解代谢途径中有关酶的过程。微生物通过诱导作用而产生的酶称为诱导酶(为适应外
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