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1、酵母菌落PCR方法酵母菌落PCR方法,酵母菌落PCR方法,涉及提取DNA方法、PCR方法问:很郁闷,最近在做电转毕赤酵母,但是转化完了没有合适的筛选方法,如果提基组的话费时费钱,而且由我这个电转的几率十分低,也就有1%-10%,所以想用菌落PCR方法筛选,但酵母菌破壁很困难,如果处理不好的话基组释放不出来,就没有阳性结果了。查了一些资料说用反复冻融法,是不是直接挑单菌落就行了呢?还有说用蜗牛酶帮助消化的,这个我倒不是很清楚,所以请各位大虾们帮帮忙,在实在是被这个伤透脑筋了!求助十万火急! 答:蜗牛酶提取DNA以后作PCR效果很稳定酵母DNA的提取1、x新鲜的菌中加入150ul(200ul)bu
2、fferiI25(30)ul蜗牛酶(30mg/ml),37度,10Min(可以30min水浴,中间隔5分钟,振荡一次,避免细胞沉到管底。2、离心10000rmp,10min,去上清,沉淀中加入bufferII250ul3、加入25ul,10%SDS。65度,30min水浴。4、加入25ul 5mol/lKAC,冰浴60分钟(4度冰箱放置就可以)5、12000rmp,15min,取上清,在上清中加入2-3倍积的无水乙醇,混匀放置20度一小时(可过夜,取出后不振荡,直接离心)6、12000rmp,15min,弃上清。7、150ul,bufferIII溶液沉淀,12000rmp,15min8、将上清
3、溶液转到干净的离心管中,加入6ul(10ug/ul),ran酶,37度,30min9、加入等积异丙醇,4度静止10min,10000rmp,5min,溶50ulbufferIII中10、如果有蛋白质可以使用酚氯仿抽提11、bufferI:0.9mol/l 山梨醇,0.1mol/l EDTA12、bufferII:50mmol/l Tris,20mmol/l EDTA 13、bufferIII:10mmol/l tris,1mol/l EDTA14、筛选AD/BD可以直接使用抗生素筛选的方法酵母菌落PCR1、酵母质粒和基组DNAPCR模版的备取对数生长期酵母菌株1.5ml,13000r/min,
4、离心15s,去上清,双蒸水洗涤一次,13000r/min 离心15s,沉淀悬浮200ulTE缓冲液中,在沸水上煮1-10min,冰浴10min,13000r/min,离心5min,将上清液储存20度取1ul用PCR2、从板上调取长势良好的菌落少许,悬浮含20ul无菌水的0.5ml eppendofff离心管中(离心管中央预先用注射器针头扎一个小孔,放置盖子受热膨胀)水浴煮沸0.2.5.10min3、利用微波炉快速备酵母治理以及菌落取直大3mm的酵母干菌落,至EP管中盖上盖子,在微波炉中加热,加入30ulTE振荡,13000r/min,离心2-5min,上清储存浴20度,取1ul来作PCR真菌D
5、NA的提取方法改良1、酵母活化后加入YEPD培养基,25-28度培养16-24小时,收集菌2、取少许新鲜的菌,加入0.6ml缓冲液I(0.9mol/l 山梨醇,0.1mol/l EDTA)1ml。0.1ml蜗牛酶(30mg/ml),37度温浴60min3、3000r/min离心10s,去上清,沉淀加入加入bufferII150mmol/l Tris,20mmol/l EDTA 1ml 10%SDS0.1ml65度,30min水浴。4、加入0.3ml ,5mol/lKAC冰浴60分钟5、10000rmp,15min,取上清,在上清中加入2-3倍积的无水乙醇,混匀放置20度一小时(可过夜,取出后不
6、振荡,直接离心)在5000-6000r/min离心15s6、沉淀用0.6ml缓冲液III10mmol/l tris,1mol/l EDTA溶解1000r/min,离心15min7、上清液转移一个干净的离心管中,加入6ul10ug/ul),ran酶,37度,30min8、加入等积异丙醇,4度静止10min,10000rmp,5min,溶50ulbufferIII中9、如果有蛋白质可以使用酚氯仿抽提后续试验思路1、提取酵母DNA2、作PCR3、筛库的引物(上CTATTCGATGATGAAGATACCCCACCAAACCC下:GTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGATT为这个引
7、物的TM值很,所以必须使用二次PCR94度,3min,95度,20miao,68度3min,68度7min,15度15min修改序94度,3min,95度,25miao,50度25miao,72度1min30s,72度5min4、利用T和B酶切(65度酶切)Taq I(AGCT)10*Taq I Basal buffer0.1%bsaPCR产物灭菌水酶BsuRI(GGCC)R buffer模版灭菌水酶5、分出不同的片断6、将DNA转到大肠杆菌中,然后提取质粒,测序或是使用抗生素筛选AMP,得到AD,kana得到BD 酵母菌落PCR2008-11-21 14:40:09 Comments (3)
8、 Views (1394) 实验心得 简介:前段时间本人做了酵母PCR实验,几经周折,终于做出来了,先将本人收集的几种酵母PCR方法介绍如下.1. 冷泉港实验室提供的经典方法,摘自(Methods in Yeast Genetics: A Cold Spring Harbor Laboratory Course Manual)(致谢华中科大杨洋老师)1)在冰上配制反应混合液: 2l 10菌落PCR缓冲液 1.2l 25mmol/L MgCl2 0.4l 10mmol/L dNTPs 10pmol 引物(每一种引物) 0.2l Taq DNA聚合酶(5U) 加水到总体积为20l 2)用移液器加微
9、量细胞(约0.25l)到PCR反应混合液中(20l反应体积) 3)PCR循环参数: 94 4分钟 94 1分钟 55 1分钟 72 2分钟 35个循环 ; 72 10分钟 4)上全部样品进行琼脂糖电泳。2. 网络上提供的一个改进版本.由于酵母细胞壁教厚,上述经典方法效果欠佳,这种方法利用SDS帮助破壁利于基因组DNA的释放 This method is more reliable than the old method of adding yeast directly to PCR tubes. No more than 1 microliter of the crude DNA should
10、 be added to the 50 microliter PCR reaction because the SDS in the DNA prep can inhibit the PCR reaction. Note: These elongation times and annealing temperatures work well for most applications where the product is less than 1.0 kb. These parameters may have to be adjusted for your specific applicat
11、ion. Platinum Taq (or other hot start Taq) gives more reliable and consistent results than regular Taq for this assay._1) Prepare Yeast DNA (this works best with fresh yeast plates) Use a pipetman tip to transfer the equivalent of a medium size yeast colony to 30 microliters of 0.2% SDSVortex 15 sec
12、onds .Heat in hot block for 4 min at 90 deg. (important for consistent DNA extraction and PCR results)Spin in microfuge 1 min. Remove supernatant to a new tube. The crude DNA can be stored at -20 degrees.2) PCR ReactionCombine the following components on ice:5 microliters 10x colony PCR buffer1.5 mi
13、croliters 50 mM MgCl21 microliter 10 mM mix of dNTPs10 pmoles of each primer (100 ng of a 25 mer oligo)2 microliters 25% Triton X-1000.3 microliter Platinum Taq Polymerase Invitrogen (5 u/microliter)H2O to a final volume of 49 microlitersAdd mix to PCR tubes on ice containing 1 microliter of the cru
14、de DNA prep from above3) PCR cycle profile: 95 deg 1 min 95 deg 30 sec 54 deg 1 min (optimum annealing temp varies according to primiers) 72 deg 1 min repeat steps 2 through 4 for a total of 35 cycles 72 deg 6 min hold at 4 deg Load 5-10 microliters to Agarose gel for assay.Warning:For DNA sequencin
15、g analysis of product, purify using QIAquick PCR purification kit (Qiagen), eluting the product in 30 microliters. Use 6 microliters for DNA sequencing analysis.Tags: 酵母菌落PCR 菌液PCR 菌液PCR检测 Comments listredstar事实上以上两中方法我都尝试过了,结果都没有P出特异的条带.我所使用的酵母是 酿酒酵母INVSC1,经过验证分析发现是我们实验室的Taq酶有问题,本实验室的Taq酶是一个不知的小牌子,
16、退火温度55度不能P出条带,结果我在女朋友实验室借了一种Fermentas Taq酶就做出结果了.2008-11-21 14:46:58 redstar根据我所在单位实验室的情况,多数采用以下方法来做酵母菌落PCR实验:(1)PCR体系(20ul)10*buffer(不含Mg2+)2ul25mM MgCl21.5ul10mM dNTP matrix0.4ulPrimer matrix(10pmol each)0.1ulTaq polymerase(Fermentas)0.5ul菌液模板 1.5ulddH2O 14ul(2)PCR程序(热启动PCR) 按照上述体系加入除酶以外的各种物质,在PCR
17、仪上94 10min,之后加入酶,继续运行程序94 15s,55 30s,72 30s 共35个循环,再72 5min酵母表达的多肽不出条带原因问:我要表达的多肽是4kd大小,该蛋白是一种抗菌肽.我用的载体是pPIC9,是分泌表达的。先简单说下我前期的工作:首先我用GS115就做了一次电转化后,MD板长了几个克隆,菌落PCR鉴定阳性率约为20%。然后进一步诱导,先挑单菌落于3mlYPD试管(30ml试管)中摇过夜,然后按1:100接种到 10mlBMGY中,诱导大约11h,OD值约2.5。然后置于超净台静止3h,换50mlBMMY培养基继续诱导,每24h补加甲醇至浓度为0.5%。从24d开始取
18、样,连续5天,最后离心取上清。1ml上清TCA浓缩至20ul,然后跑tricine-sds,分离胶、夹层胶和浓缩胶浓度分别为 16.5% 10% 4%。已经跑了2个多月的蛋白电泳了,一无所获。做了一次抑菌活性也没有抑菌圈出现。自己分析可能有以下原因,同时希望有经验的战友给些建议,下次应该从那些方面调整一下,先谢过了!1)BMGY诱导期od值应在2-6,但不同的od值可能蛋白表达量也不同吧,正在考虑取3、4、5、6不同值进行摸索,不知有没有必要呢?望大家能给些建议!2)BMGY和BMMY之间的体积比不是很明白,我筛选的表型是Muts,是不是应该BMMY体积小些,这样诱导的菌体密度大些?一直用1:
19、5的体积即10mlBMGY换到50mlBMMY中,也试过1:2也没有结果。不知道这个是不是一个影响因素呢?3)为防止换液带来的污染,我一直都是静止换液,即测过BMGY od2.5以后静止3h,不知静止过程od值是否改变了很多?4)甲醇对表达量的影响,好像甲醇添加范围是0.5-2%。 我是添加甲醇到0.5%,用不用提高一下添加量啊?5)我用的超低分子量marker,3kd-20kd,电泳能跑出来,说明我的胶浓度没问题吧,但是 GS115对照跑不出来,是因为条带太大没分离出来吗6)还有怀疑浓缩方法是否得当?是不是不同的蛋白针对不同的浓缩方法?自己先分析了这么多,试验进行不下去了,还耗掉了这么多时间
20、,实在着急啊 希望大家帮看看找找原因,多谢了!答1:1、首先要把pPICZ protocol看仔细了,我记得muts型的好象是BMGY 浓缩5倍到BMMY,而您是稀释.2、换液不要那么苛刻,有污染都没什么问题的,OD值已经那么高了,有杂菌也长不起来的.3、甲醇0.5%的浓度够了,要有表达,也该出来.4、测活方法和Tricine胶都没问题,个人觉得还是您样品处理的问题,样品浓缩倍数越高越好.可以冻干后在溶解浓缩; 您再打孔测活,孔干了再加样,看有无活性,然后再做后面的分析和优化,祝好运! 答2:你好我以前也做酵母表达的,我说说我的看法吧:1、你的电转效率也太低了吧,才长几个。等你用PCR鉴定出阳
21、性不就只剩下一两个克隆了吗?这样少的克隆数做表达,不出来也是很正常啊。2、在BMGY里还是让OD值高些,大慨到4-5左右,稀释后让OD值到1左右就可以。3、另外有其他的run小肽胶的方法,你可以试试,可能分辨率会好一些。4、你可以不浓缩,用银染看看。主要是觉得你筛选的克隆太少了。关于酵母菌落PCR的几个问题想确定一下筛选得到的几个酵母菌的基因是否发生了突变,但是提基因组又太麻烦,所以想做一下菌落,但是有几个问题不是很清楚,首先,挑取菌落要挑多少比较合,挑取后细胞怎么样破壁比较好,因为使酵母,比较难破壁;再者,的缓冲液是一般的就行吗?还是需要特定的菌落缓冲液呢?反应体系中还需要加入吗?谢谢!酵母
22、菌落PCR不需要特殊的处理,用一般的PCR缓冲液就行。我的方法是:1.挑少量菌体至10微升无菌水中,不要挑太多,否则P不出来。只要看着水刚刚有一点浑浊就行 了。如果你嫌水少,不好判断,可以用大体积的水,我就是靠肉眼判断水的浑浊度来确定菌体量的。2.在零下20或零下80度冻5分钟,然后沸水浴2到3分钟,如此反复2到3次。3.高速Vortex1分钟4.取1微升作为PCR的模版。成功与否的关键是菌体的量的多少。菌体过多了,细胞壁的一些组分会抑制PCR反应。电转化感受态细胞的制备过程: 1.用枪头挑取单克隆菌落,投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。(同时做培养基和枪头的空白对照)2.3
23、7,220rpm,培养14-16个小时。3.第二天,以1:100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中,37度,220rpm,振摇2-3小时,每半小时测一次OD,当OD值达到0.3-0.4时,停止培养。4.将菌液在冰上预冷30分钟,随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中,4,2500rpm离心10分钟。5.弃上清,离心杯中加入少量ddH2O,使沉淀悬浮后,再将水注满离心杯,4,4000rpm离心10分钟。6.弃上清,加少量灭菌水,重悬菌体,再将水注满离心杯,4000rpm,4,离心10min。7.弃上清,往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌,预冷),重悬菌体,再加满10%甘油, 4, 4000rpm, 离心10min。8.弃上清,每个离心杯中加入5ml10%的甘油,使沉淀悬浮后,将菌液以300ul/管分装于1.5ml的离心管中,-80 冰箱中保存。同时取100 l感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化,检测转化效率。9. 次日观察转化子生长情况,并记录。
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