酶工程实验 讲义.doc
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1、酶工程实验讲义生物学实验教学中心实验二 大肠杆菌菌体总蛋白的超声破碎抽提与蛋白质的凝胶过滤纯化 实验原理利用溶菌酶、反复冻融或超声波破碎的方法将培养的细菌的细胞壁破碎后,可使那些可溶性的蛋白释放出来,再利用硫酸铵沉淀、蛋白质层析技术和制备电泳等方法能够将蛋白分离纯化出来,供进一步的研究使用。超声破碎时要产生大量的热,会引起蛋白的变性。为了避免产生高温,超声时一般使用间隔的脉冲处理,而且应在冰浴中进行。 凝胶是一种多孔性的不带表面电荷的物质,当带有多种成分的样品溶液在凝胶内运动时,由于它们的分子量不同而表现出速度的快慢,在缓冲液洗脱时,分子量大的物质不能进入凝胶孔内,而在凝胶间几乎是垂直的向下运
2、动,而分子量小的物质则进入凝胶孔内进行“绕道”运行,这样就可以按分子量的大小,先后流出凝胶柱,达到分离的目的仪器、试剂和材料 1、 大肠杆菌2、细菌蛋白抽提液(100mmol/L NaCl,10mmol/L EDTA, pH 8.0) 3、恒温摇床 4、小型高速离心机 5、超声波组织细胞破碎仪 6、玻璃试管,三角瓶 7、1.5mL和5mL 塑料离心管 8、“枪”,枪头实验操作1、大肠杆菌的培养: 从过夜培养的大肠杆菌LB琼脂平板上挑取2-3个菌落,接种5mL LB的玻璃试管中,放恒温摇床中,37培养过夜。2、超声破碎抽提:将培养的大肠杆菌培养物转移到数只5mL离心管中,8000转/分离心5分钟
3、,倾去上清液后,在沉淀上面再加培养物,继续离心,将所有的培养物都收集在一起。每管中加入1.5mL的细菌蛋白抽提液(100mmol/L NaCl,10mmol/L EDTA, pH 8.0),用枪吹打,使沉淀悬浮。将离心管放在小试管架上,将超声波破碎仪的金属头插到离心管中,调整好试管的位置后关上超声破碎仪的门,打开仪器的电源,对每只离心管中的菌体进行超声破碎。条件:功率80瓦,工作2秒,间隔2秒,每一次处理5个循环。4次处理后,8000转/分离心5分钟。取出离心管,在显微镜下观察菌体的破碎情况。如果在显微镜下仍能看到菌体,则需进一步破碎。菌体完全破碎后,8000转/分离心5分钟弃细胞碎片,上清转
4、移至1.5ml离心管,即得蛋白粗提液,备凝胶层析用,或冷冻于-20。 3. 凝胶层析实验操作步骤:3. 1.凝胶的预处理交联葡聚糖凝胶的市售商品多为干燥颗粒,使用前必须充分溶胀。方法是将欲使用的干凝胶缓慢地倾倒入510倍的去离子水中,参照相关资料中凝胶溶胀所需时间,进行充分浸泡,然后用倾倒法除去表面悬浮的小颗粒,并减压抽气排除凝胶悬液中的气泡,准备装柱。在许多情况下,也可采用加热煮沸方法进行凝胶溶胀,此法不仅能加快溶胀速率,而且能除去凝胶中污染的细菌,同时排除气泡。表1凝胶型号和层析柱大小与规格及凝胶用量层析柱规格凝胶的规格和用量(g)直径(cm)高(cm)容量(ml)G25G50G100G2
5、000.9159.52.510.60.30.93019521.20.60.960381042.51.21.620401042.51.21.640802085.02.41.67014035149.04.41.6100200502012.562.64021050201272.670370903520122.62.6100605301 00013025050110307017353.2.装柱层析柱的选择一般根据分离样品的种类和样品的数量而定。纯化蛋白质时,柱床体积应为样品体积的25100倍。去除盐及游离荧光素约为样品体积的410倍。柱太短,影响分离效果。柱长一些,分离效果好,但柱太长,则延长分离时间
6、,样品也稀释过度。层析柱的内径也要选择适当。内径过细,会发生“器壁效应”,即靠近管壁的流速要大于中心的流速影响分离效果。所以层析柱的内径和高度应有一定的比例。对于除盐来说应为15125;对于纯化蛋白质来说应为1201100。凝胶柱的装填方法和要求,基本上与离子交换柱的制备相同。一根理想的凝胶柱要求柱中的填料(凝胶)密度均匀一致,没有空隙和气泡。通常新装的凝胶柱用适当的缓冲溶液平衡后,将带色的蓝色葡聚糖2000、细胞色素,或血红蛋白等物质配制成质量浓度为2g/L的溶液过柱,观察色带是否均匀下移,以鉴定新装柱的技术质量是否合格,否则,必须重新装填。3.3.加样与洗脱(1)加样量:加样量与测定方法和
7、层析柱大小有关。如果检测方法灵敏度高或柱床体积小,加样量可小;否则,加样量增大。例如利用凝胶层析分离蛋白质时,若采用280nm波长测定吸光度,对一根2cm60cm的柱来说,加样量需5mg左右。一般来说,加样量越少或加样体积越小(样品浓度高),分辨率越高。通常样品液的加入量应掌握在凝胶床总体积的510。样品体积过大,分离效果不好。对高分辨率的分子筛层析,样品溶液的体积主要由内水体积(Vi)所决定,故高吸水量凝胶如Sephadex G-200,每mL总床体积可加0.30.5mg溶质,使用体积约为0.02倍总体积;而低吸水量凝胶如Sephadex G75,每mL总床体积加溶质质量为0.2mg,样品体
8、积为0.0l倍总体积。(2)加样方法:如同离子交换柱层析一样,凝胶床经平衡后,吸去上层液体,待平衡液下降至床表面时,关闭流出口,用滴管加入样品液,打开流出口,使样品液缓慢渗入凝胶床内。当样品液面恰与凝胶床表面持平时,小心加入数mL洗脱液冲洗管壁。然后继续用大量洗脱液洗脱。(3)洗脱:加完样品后,将层析床与洗脱液储瓶、检测仪、分部收集器及记录仪相连,根据被分离物质的性质,预先估计好一个适宜的流速,定量地分部收集流出液,每组分一至数mL。各组分可用适当的方法进行定性或定量分析。凝胶柱层析一般都以单一缓冲溶液或盐溶液作为洗脱液,有时甚至可用蒸馏水。洗脱时用于流速控制的装置最好的是恒流泵。若无此装置,
9、可用控制操作压的办法进行。样品体积不宜过多,最好为床体积的15%,最多不要超过10%。样品浓度也不宜过大,浓度过大粘度大,分离效果差,一般不超过4%。洗脱液应与膨胀一致,否则更换溶剂,凝胶体积会发生变化,影响分离效果。洗脱液要有一定的离子强度和pH值。分离血清蛋白常用0.020.1mol/L pH 6.98.0的PBS液(0.14mol/L NaCl)和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl缓冲盐溶液(0.14mol/L NaCl)。3.4 凝胶柱的重复使用与保存 当样品的各组分全部洗脱下来之后,即可加入新的样品,继续使用。保存方法有三种: 在液相中保存最方便,即于凝胶悬液中加入防腐剂(
10、一般为0.02%NaN3或0.002%洗必泰)或高压灭菌后4保存。此法至少可以保存半年以上。 用完后,以水冲洗,然后用60%70%酒精液冲洗,凝胶体积缩小,即在半收缩状态下保存。 长期不用者,最好以干燥状态保存,即水洗净后,用含乙醇的水洗,逐渐加大乙醇用量,最后用95%的乙醇洗,可全部去水,再用乙烯去除乙醇,抽滤干,于 6080干燥后保存。【注意事项】一、超声波细胞破碎仪使用注意事项:1 、切记空载(一定要将超声变幅杆插入样品后才能开机,)2、变幅杆(超声探头)入水深度: 1.5cm 左右,液面高度最好有30mm以上,探头要居中,不要贴壁。超声波是垂直纵波,插入太深不容易形成对流,影响破碎效率
11、。3、超声参数设置:设置键好仪器工作参数(具体设置见说明书或来电咨询),对于对温度要求比较敏感的样品(比如细菌)一般外面采用冰浴,实际温度肯定是低于25,蛋白核酸肯定不会变性。1) 时间:超声时间每次最好不要超过5秒 ,间隙时间应大于或等于超声时间,以便于热量散发。时间设定应以超声时间短,超声次数多原则,可延长超声机子以及探头的寿命。2) 超声功率: 不宜太大,以免样品飞溅或起泡沫, 如小于10ml样品容量,功率应在200w以内,选用2mm超声探头,另将面板后面的变幅杆选择开关打到相应挡;10-200ml样品容量的功率在200400w,选用6mm超声探头,另将面板后面的变幅杆打到相应挡;200
12、ml以上的样品容量功率在300-600w之间,选用10mm超声探头,另将面板后面的变幅杆打到相应挡;(2MM的小探头功率严禁超过350W)3) 容器选择:有多少的样品就选多大的烧杯,这样也是有利样品在超声中对流,提高破碎效率。例如;20mL的处理量最好用20mL的烧杯。 如100ml大肠杆菌样品设置参数: 超声5秒 间隙5秒 次数70次(总时间为10分钟)。功率300W(仅供参考) 500mL左右的量,功率开到500W-800W左右4、若样品放在1.5ml的EP管里请一定要将EP管固定好,以防冰浴融化后液面下降导致空载5、日常保养:用完后用酒精擦洗探头或用清水进行超声!二、凝胶层析注意事项1装
13、柱后要检查柱床是否均匀,若有气泡或分层的界面时,需要重新装柱。2流速不可太快,否则分子小的物质来不及扩散,随分子大的物质一起被洗脱下来,达不到分离目的。【思考题】1凝胶过滤的原理是什么?是否小的分子流速快?为什么?2凝胶过滤的操作应注意些什么?实验三 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分离蛋白质【实验目的】1. 了解和掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的技术和原理;2. 掌握用此法分离蛋白质组分的操作方法。【实验原理】在酶工程、生物化学、分子生物学和基因(遗传)工程实验中,常常要进行蛋白质和核酸的分离工作。聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel Electrophoresis, PA
14、GE)是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质进行蛋白质或核酸分离的一种电泳方法。聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体(acrylamide,简称ACR)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N,N-methylene bisacrylsmide 简称BIS)在催化剂的作用下聚合交联而成的三维网状结构的凝胶。通过改变单体浓度与交联剂的比例,可以得到不同孔径的凝胶,用于分离分子量大小不同的物质。聚丙烯酰胺凝胶聚合的催化体系有两种:(1)化学聚合:催化剂采用过硫酸铵,加速剂为N,N,N,N四甲基乙二胺(简称TEMED)。通常控制这二种溶液的用量,使聚合在1小时内完成。(2)光聚合:通常用核黄素为催化剂,通过控制光照时间
15、、强度控制聚合时间,也可加入TEMED加速反应。聚丙烯酰胺凝电泳常分为二大类:第一类为连续的凝胶(仅有分离胶)电泳;第二类为不连续的凝胶(浓缩胶和分离胶)电泳。一般地,不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳有三种效应:电荷效应(电泳物所带电荷的差异性); 凝胶的分子筛效应(凝胶的网状结构及电泳物的大小形状不同所致)。浓缩效应(浓缩胶与分离胶中聚丙烯酰胺的浓度及pH的不同,即不连续性所致)。因此,样品分离效果好,分辨率高。SDS即十二烷基硫酸钠(Sodium Dodecyl Sulfate,简称SDS)是阴离子表面活性剂,它能以一定比例和蛋白质结合,形成一种SDS-蛋白质复合物。这时,蛋白质即带有大量的负电荷
16、,并远远超过了其原来的电荷,从而使天然蛋白质分子间的电荷差别降低仍至消除。与此同时,蛋白质在SDS作用下结构变得松散,形状趋于一致,所以各种SDS-蛋白质复合物在电泳时产生的电泳迁移率的差异,仅仅取决于蛋白质的分子量。另外,SDS-蛋白质复合物在强还原剂 (巯基乙醇)存在下,蛋白质分子内二硫键被打开,这样分离出的谱带即为蛋白质亚基。当分子量在15KD到200KD之间时,蛋白质的迁移率和分子量的对数呈线性关系,符合下式:logMW=K-bX,式中:MW为分子量,X为迁移率,k、b均为常数。本实验采用化学聚合法制胶,进行不连续的凝胶电泳,并用考马斯亮蓝快速染色,以分离和鉴定大肠杆菌菌体、发酵液中和
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