食品酶学复习资料.doc
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1、求职材料的制作与样例图解蝴蝶百科全书(英文版) part 4.pdf 什么是酶?酶是生物体产生的一类具有生物催化活性的生物大分子。国际系统命名法 系统名称包括底物名称、反应性质,最后加一个酶字。 例如: 习惯名称:葡萄糖磷酸转移酶 系统名称: ATP:葡萄糖磷酸转移酶 酶催化的反应: ATP + D葡萄糖 ADP + D葡萄糖-6-磷酸 分类编号是:E.C.2.7.1.1(1) 氧化-还原酶 Oxidoreductase 氧化-还原酶催化氧化-还原反应。 主要包括脱氢酶(dehydrogenase)和氧化酶(Oxidase)。 如,乳酸(Lactate)脱氢酶催化乳酸的脱氢反应。(2) 转移酶
2、 Transferase 转移酶催化基团转移反应,即将一个底物分子的基团或原子转移到另一个底物的分子上。例如, 谷丙转氨酶催化的氨基转移反应。 (3) 水解酶 hydrolase 水解酶催化底物的加水分解反应。 主要包括淀粉酶、蛋白酶、核酸酶及脂酶等。 AB+H2OAOH+BH 例如,脂肪酶(Lipase)催化的脂的水解反应:(4) 裂解酶 Lyase 裂合酶催化从底物分子中移去一个基团或原子形成双键的反应及其逆反应。 主要包括醛缩酶、水化酶及脱氨酶等。 21或12,A+B AB 例如, 延胡索酸水合酶催化的反应。(5) 异构酶 Isomerase 异构酶催化各种同分异构体的相互转化,即底物分
3、子内基团或原子的重排过程。例如,6-磷酸葡萄糖异构酶催化的反应。(6) 合成酶 Ligase or Synthetase 合成酶,又称为连接酶,能够催化C-C、C-O、C-N 以及C-S 键的形成反应。这类反应必须与ATP分解反应相互偶联。 A + B + ATP + H-O-H =A B + ADP +Pi 例如,丙酮酸羧化酶催化的反应。 丙酮酸 + CO2 草酰乙酸 系统名一般都比较长,使用起来不方便,在许多场合下仍采用惯用名。但在科技文献中,当一种酶作为主要研究对象时,应在文中第一次出现时标明其系统名、数字编号以及酶的来源。 例如乙醇脱氢酶在文中第一次出现时应标明“乙醇:NAD+ 氧化还
4、原酶(EC1.1.1.1),来源于酵母”,其后则可以使用惯用名“乙醇脱氢酶”。如果酶不是文献中的主要研究对象(例如只是作为试剂使用),则只需在第一次出现时在惯用名后的括号中标明酶的数字编号如“乙醇脱氢酶(EC1.1.1.1)” 1 高效性 2酶的专一性 Specificity又称为特异性,是指酶在催化生化反应时对底物的选择性 酶的专一性包括 (1)结构专一性 绝对专一性 相对专一性 (2)立体异构专一性 光学异构专一性 几何异构专一性绝对特异性:一种酶只作用于一种底物产生一定反应生成一种特定的产物。如:相对特异性:作用于一类化合物或一种化学键。如脂肪酶、磷酸酶和蛋白水解酶等。l 别构酶也称变构
5、酶。这种酶除了有活性中心外,还有别构中心,当别构效应物非共价结合到别构中心上时,酶分子构象发生改变,从而改变酶活力。第二章 酶的生产方法l 组织提取:木瓜蛋白酶、凝乳蛋白酶l 微生物发酵:最大量的来源l 化学及生物合成:生物重组为什么用微生物来进行生产o (1) 微生物生长繁殖快,生活周期短。因此,用微生物来生产酶产品,生产能力(发酵)几乎可以不受限制地扩大,能够满足迅速扩张的市场需求。o (2) 微生物种类繁多,它们散布于整个地球的各个角落,而且在不同的环境下生存的微生物都有其完全不同的代谢方式,能分解利用不同的底物。o (3) 这一特征就为微生物酶品种的多样性提供了物质基础。o (4)特别
6、是当基因工程介入时,动植物细胞中存在的酶,几乎都能够利用微生物细胞获得。 产酶菌种的要求 :1、发酵周期短,产量高;2、容易培养和管理;3、产酶稳定性好,不易变异退化,不易被感染;4、有利于酶的分离和纯化;5、安全性可靠,非致病菌。产酶微生物的分离和筛选(要详细)步骤o 样品的采集o 富集培养o 分离o 初筛复筛4.1 优良糖化酶菌株的分离与筛选融化培养基倒平板打散孢子团粒梯度稀释涂布平板培养观察滴加碘液挑菌落接种培养糖化酶活力测定菌种保存4.2 酸乳制品中的乳酸菌的分离制培养基倒平板梯度稀释涂布平板培养观察挑菌落接牛乳管培养观察传代培养挑选凝乳管乳酸测定菌种保存5 步骤5.1 优良糖化酶菌株
7、的分离与筛选(1)融化淀粉察氏培养基,稍冷后倒平板与斜面数个。(2)取种曲少许,加入10mL带玻璃球的无菌生理盐水的三角瓶中,用力振荡打散孢子团粒,使之形成均匀的孢子悬浮粒。然后将其用无菌纱布过滤于无菌试管中。(3)将上述滤液以10倍稀释法知释至10-7,取后3个稀释度的稀释液各0.2mL,于淀粉察氏培养基平板上用无菌涂布器分别依次涂布2至3个皿,30培养12d。(5)性能测定:测定各菌落的糖化酶活力。5.2 酸乳制品中的乳酸菌的分离(1)制备BCG牛乳营养琼脂培养基。称取脱脂奶粉10g,溶于50mL水中,加入1.6%溴甲酚绿酒精溶液0.07mL,0.075MPa压力下灭菌20min。另取琼脂
8、2g,溶于50mL水中,加酵母膏1g,溶解后调pH值至6.8,0.1MPa压力下灭菌20min。趁热将上述两液以无菌操作混合均匀,倒平板6个,待凝固后,置37培养24h,若无杂菌生长,即可使用。(2)将样品以10倍稀释法稀释至10-7,取其中10-7、10-6 2个稀释度的稀释液各0.10.2mL,分别置于上述各营养平板上,用无菌涂布器依次涂布2至3个皿,置43培养48h,如出现圆形稍扁平的黄色菌落及其周围培养基亦为黄色者初步定为乳酸菌。(3)将典型菌落转至脱脂乳发酵管,43培养824h,若牛乳管凝固,无气泡,呈酸性,镜检细胞杆状或链球状,革兰氏染色呈阳性,则将其连续传代若干次,43培养,挑选
9、出在34h能凝固的乳管,保存备用。o (4)乳酸菌的鉴定及生物量的测定。诱导和阻遏(选择判断)乳糖操纵子的结构E.coli能利用乳糖作为碳源,而利用乳糖作为碳源的酶只有当乳糖成为唯一碳源时才被合成。l 乳糖操纵子由三个结构基因(lacZ 、 lacY和 lacA)、操纵基因Olac、启动基因Plac、和调节基因lacI所组成(图) lacZ,编码-半乳糖苷酶l lacY,编码 -半乳糖苷透性酶 lacA,编码硫代半乳糖苷乙酰转移酶l Olac ,它位于启动子5端的-5至+21之间。该位点可被乳糖阻抑蛋白相结合。l lacI ,它是一个独立的调节基因,编码乳糖阻抑蛋白。酶合成的阻遏(1)酶合成的
10、反馈阻遏作用(末端代谢物阻遏、产物阻遏作用) 酶催化作用的产物或代谢物途径的末端产物使该酶的生物合成受阻。引起反馈阻遏的物质,称为共阻遏物(辅阻遏物)。 组氨酸对组氨酸合成途径中的10种酶的生物合成均起反馈作用o 当细菌在含有葡萄糖和乳糖的培养基中生长时,通常优先利用葡萄糖,而不利用乳糖。只有当葡萄糖耗净后,细菌经过一段停滞期,不久在乳糖的诱导下-半乳糖苷酶开始合成,细菌才能充分利用乳糖。这种现象过去称为葡萄糖效应。后来了解到这是由于葡萄糖降解物引起的,因此又称为降解物阻遏(catabolite repression)。诱导的定义在正常细胞中没有或只有很少量存在,但在酶诱导的过程中,由于诱导物
11、的作用而被大量合成的酶。活化:使用以前,必须接种于新鲜的斜面培养基上,在一定条件下进行培养,以恢复细胞的生命活动能力。扩大培养:增加发酵时的数量,经过一级至数级扩大培养。培养基称为种子培养基。培养基:培养基的营养成分(1)碳源(2)氮源(3)无机盐(4)生长因素pH值调节:“治标”、“治本”2、温度调节:热水升温、冷水降温3、溶解氧的调节控制:提高溶氧速率:通气量、氧的分压、气液接触时间和面积,培养液的性质。酶合成的调节机制:在正常情况下,酶产量受酶合成调节机制的控制,要提高酶产量必须打破这种调节控制。酶合成主要取决于转录水平的调节,原核生物中普遍公认的调节机制是操纵子理论。打破酶合成调节限制
12、的方法:一、通过条件控制提高酶产量:1、添加诱导物 ( 1 )酶的底物(2)酶作用底物的前体物质(3)酶的反应产物(4)酶的底物类似物或底物的修饰物2、降低阻遏物浓度3、通过发酵条件的控制4、添加产酶促进剂二、通过基因突变提高酶产量:1、自然选育2、诱变育种使诱导型变为组成型,使阻遏型变为去阻遏型三、其他酶催化一定化学反应的能力称酶活力活力单位:规定条件(最适条件)下,一定时间内催化完成一定化学反应量所需的酶量。 国际单位(U):指在最适条件下,1分钟内催化1微摩尔(umol)底物的酶量,或是转化1微摩尔(umol)底物中的有关基团的酶量。 Katal:指在最适条件下,每秒钟催化1mol底物转
13、化所需的酶量。简称Kat酶的比活力:是指每mg蛋白所含的酶活力单位或每kg蛋白中所含的Kat数。比活力是表示酶制剂纯度的一个指标1、提取的主要方法: 大多数酶蛋白是属于球蛋白,因此,可用稀盐,稀碱或稀酸的水溶液进行抽提;抽提液的具体组成和抽提条件的选择取决于酶的溶解性 ,稳定性以及有利于切断酶与其它物质的连结。(1)盐溶液提取(2)酸溶液提取(3)碱溶液提取4)有机溶剂提取2、酶提取过程的注意事项(判断理解题)1、pH的选择 :首先考虑酶的稳定性;其次应远离等电点;一般选择pH4-6为宜。2、盐的选择:大多数酶在低浓度的盐溶液中有较、大的溶解度,一般选择等渗盐溶液,如0.02-0.05 mol
14、/L的磷酸缓冲液或0.15 mol/L的NaCl等。3、温度的选择:一般控制在0-10 0C,如果酶比较稳定可以例外。4、抽提液用量:常采用材料量的1-5倍。二、酶分离纯化过程中: 在每一步都要测定3个数据:酶活力;比活力;体积。一、酶分离纯化方法的选择 目前酶的分离纯化方法都是根据酶与杂蛋白的性质差异而建立的,在选择分离纯化方法时,要考虑以下几个方面:1、首先对待纯化的酶的理化性质有比较全面的了解;2、以酶活力和比活力为标准,判断所选择的方法是否得当;3、严格控制操作条件,防止酶的变性失活。酶分离纯化方法的选择 性质 方法v 分子大小 透析、超滤、密度梯度离心、凝胶 、过滤v 溶解度 等电点
15、沉淀、盐析、有机溶剂沉淀v 电荷 电泳、离子交换层析v 吸附性质 吸附层析(羟基磷灰石层析、疏水作用层析)v 对配体分子的生物亲和力 亲和层析超过滤(Ultrafiltration)法:利用压力或离心力强行使溶质按大小形状的差异分开,将所需的酶分子被滤膜截留,而其它较小的分子随溶剂被压到膜的另一侧。分子筛:通过蛋白质的分子大小分离纯化的一种方法。将网孔状介质装于层析柱中,大分子蛋白质不进入孔中直接流出速度最快,中等大小蛋白质进入中等大小的孔,小分子物质进入所有孔速度最慢。 用速度差来分离纯化。分子筛是一种包含有精确和单一的微小孔洞的材料,可用于吸附气体或液体。足够小的分子可以通过孔道被吸附,而
16、更大的分子则不能。与一个普通筛子不同的是它在分子水平上进行操作。盐析的机理0蛋白质盐析是指加入轻金属盐溶液使其在水中的溶解度降低,从而达到变性的目的。不过,该变性是可逆的,只要向其中加入大量水,蛋白质还会溶解。第三章动力学酶催化反应动力学也称酶促反应动力学(kinetics of enzyme-catalyzed reactions),是研究酶促反应速度以及影响此速度的各种因素的科学。在研究酶的结构与功能的关系以及酶的作用机制时,需要酶促反应动力学提供相关的实验证据;为了找到最有利的反应条件从而提高酶催化反应的效率以及了解酶在代谢过程中的作用和某些药物的作用机制等,也需要我们掌握酶促反应动力学
17、的相关规律。因此,对于酶促反应动力学的研究既有重要的理论意义又具有相当的实践价值。酶的动力学研究包括哪些内容 ?酶促反应动力学以化学动力学为基础,通过对酶促反应速度的测定来讨论诸如底物浓度、抑制剂、温度、pH和激活剂等因素对酶促反应速度的影响。引起酶促反应速度随反应时间延长而降低的原因很多,如底物浓度的降低、产物浓度增加从而加速了逆反应的进行、产物对酶的抑制或激活作用以及随着反应时间的延长引起酶本身部分分子失活等等。因此在测定酶活力时,应测定酶促反应的初速度,从而避免上述各种复杂因素对反应速度的影响。由于反应初速度与酶量呈线性关系,因此可以用测定反应初速度的方法来测定相关制剂中酶的含量。Km值
18、就代表着反应速度达到最大反应速度一半时的底物浓度。 由于抑制作用与变性作用从本质而言是不同的,因此与变性剂对酶的变性作用无选择性不同的是,抑制剂对酶的抑制作用是有选择性的,即一种抑制剂只能使某一种酶或对某一类酶产生抑制作用。变性:指在外界理化因素的影响下,蛋白质的次级键被打断,而肽键未断,蛋白质的空间结构遭到破坏,而一级结构未改变导致蛋白质的理化性质和生物学功能改变理化性质改变 1不对称性增加,粘稠度增加2易同化学试剂起反应3易被蛋白酶水解4功能减弱或丧失5往往会沉淀:蛋白质变性后往往会沉淀,但沉淀的蛋白质不一定变性根据抑制剂与酶的作用方式的区别以及抑制作用是否可逆,我们可以将抑制作用分为两大
19、类,即:不可逆的抑制作用和可逆的抑制作用。由于抑制剂与酶的必需基团以共价键的形式结合而引起酶活力降低或丧失,因此不能用透析、超滤等物理方法去除抑制剂而使酶复活,这种抑制作用是不可逆的,我们称之为不可逆抑制。此时被抑制的酶分子受到抑制剂对其不同程度的化学修饰,因此不可逆抑制从本质上来说就是酶的修饰抑制。专一性不可逆抑制剂 可以分为Ks型和Kat型两大类。a)Ks型不可逆抑制剂:具有与底物相类似的结构b)Kat型不可逆抑制剂:该类抑制剂不但具有与天然底物相类似的结构,而且抑制剂本身也是酶的底物,这类不可逆抑制剂的特点是专一性极高,因此也被称为自杀性底物(suicide substrate)。可逆的
20、抑制作用由于抑制剂与酶以非共价键的形式结合而引起酶活力降低或丧失,但是能用透析、超滤等物理方法除去抑制剂而使酶复活,这种抑制作用是可逆的,我们称之为可逆抑制(reversible inhibition)。根据可逆抑制剂与底物的关系,我们将可逆抑制作用分为三种类型,它们分别是竞争性抑制、非竞争性抑制和反竞争性抑制。竞争性抑制(competitive inhibition) :是最常见的一种可逆抑制作用。抑制剂(I)与底物(S)竞争酶(E)的同一结合部位,因此抑制剂的存在直接影响底物与酶的正常结合。这是由于酶的活性部位不能同时既与底物结合又与抑制剂结合,所以在底物和抑制剂之间会产生竞争,从而形成一
21、定的平衡关系。对于绝大多数竞争性抑制剂而言,其结构与底物结构十分类似,因此也能与酶的活性部位结合形成可逆的酶-抑制剂复合物EI,但酶-抑制剂复合物EI不能分解成产物P,导致相应的酶促反应速度下降。其抑制程度取决于底物和抑制剂的相对浓度,可以通过增加底物浓度的方法来解除这种抑制作用。这类抑制最典型的例子是丙二酸和戊二酸竞争与琥珀酸脱氢酶结合,但不能催化脱氢反应。非竞争性抑制(noncompetitive inhibition) :这类抑制作用的特点是底物(S)和抑制剂(I)可以同时与酶(E)结合,两者之间不存在竞争关系。但是在酶与抑制剂结合后,还可以进一步与底物结合形成酶-底物-抑制剂复合物ES
22、I;酶与底物结合后,也可以进一步与抑制剂结合形成酶-底物-抑制剂复合物ESI。但是这种中间的三元复合物,即酶-底物-抑制剂复合物ESI不能进一步分解产生产物,因此相应的酶促反应速度下降。由于这类抑制剂与酶活性部位以外的基团相结合,因此其结构与底物结构并无相似之处,而且不能用增加底物浓度的方法来解除这种抑制作用,故称非竞争性抑制。这类抑制最典型的例子是亮氨酸是精氨酸酶的一种非竞争性抑制剂。还有某些重金属离子如Ag+、Cu2+、Hg2+、Pb2+等对酶的抑制作用也属于这一类。反竞争性抑制(uncompetitive inhibition) :这类抑制作用的特点是只有在酶(E)与底物(S)结合后,才
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