白藜芦醇对肝癌Bel7404细胞增殖、凋亡及侵袭的影响.doc
《白藜芦醇对肝癌Bel7404细胞增殖、凋亡及侵袭的影响.doc》由会员分享,可在线阅读,更多相关《白藜芦醇对肝癌Bel7404细胞增殖、凋亡及侵袭的影响.doc(10页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、DOC格式论文,方便您的复制修改删减白藜芦醇对肝癌Bel7404细胞增殖、凋亡及侵袭的影响(作者:_单位: _邮编: _) 【摘要】 目的研究白藜芦醇对肝癌Bel7404细胞增殖、凋亡及侵袭的影响。方法MTT法和增殖细胞核抗原(PCNA)测定法检测白藜芦醇对Bel7404细胞增殖的影响;流式细胞术和TdT酶介导的dUTP缺口末端标记法检测白藜芦醇对Bel7404细胞凋亡的影响;黏附实验、运动实验和侵袭实验检测白藜芦醇对Bel7404细胞侵袭能力的影响。结果白藜芦醇浓度25 mol/L可抑制肝癌细胞Bel7404增殖,并诱导凋亡(P0.01);浓度100 mol/L正常肝细胞L02的增殖也受到抑
2、制,并产生凋亡(P0.01)。25,50 mol/L的白藜芦醇可抑制Bel7404细胞黏附细胞外基质纤连蛋白(FN)及降解基质的能力(P0.01),对该细胞的运动能力无明显抑制作用。结论一定浓度的白藜芦醇可抑制肝癌Bel7404细胞增殖,诱导其凋亡,并可能通过抑制Bel7404细胞与细胞外基质FN的黏附及对基质的降解来抑制Bel7404细胞的侵袭能力;在较高浓度下(100 mol/L),白藜芦醇对正常肝细胞株也产生抑制增殖和诱导凋亡的毒性作用。 【关键词】 藜芦生物碱类 癌 肝细胞 肝肿瘤 细胞增殖 细胞凋亡 肿瘤侵润 自从葡萄酒中发现白藜芦醇以来,人们陆续发现它具有保护心肌细胞、改善微循环、
3、抑制血小板聚集、抗内毒素休克、降血脂、抗脂质过氧化、镇咳、平喘、抗病原微生物及抗老年痴呆等众多生理功能。近年来又发现白藜芦醇具有抗肿瘤功能,表现为对某些肿瘤的起始、促进、进展3个阶段均有抑制作用1。白藜芦醇并非对所有肿瘤都有抑制作用,而且其抗肿瘤机制目前尚不明确。肝癌为我国最常见的恶性肿瘤之一,是重要的抗肿瘤研究对象。笔者从肿瘤细胞增殖、凋亡及侵袭方面探讨白藜芦醇的抗肝癌细胞株机制,以及对正常肝细胞的毒性作用。 1材料与方法 1.1材料肝癌细胞Bel7404及正常肝细胞L02均由福建省肝胆外科研究所提供;白藜芦醇由福建师范大学生物工程学院提纯生产(纯度约99.8%);RPMI 1640和DME
4、M培养基(美国Gibco公司);噻唑蓝(thiazolylblue,MTT)、胰蛋白酶(北京华美生物科技有限公司);PCNA试剂盒(福州迈新生物技术开发有限公司);TUNEL试剂盒(美国Premega公司);Transwell小室(美国Corning公司);纤连蛋白(FN)和基底膜基质凝胶Matrigel(美国BD公司)。 1.2细胞培养肝癌细胞Bel7404在含10%小牛血清的RPMI 1640中、L02在含10%小牛血清的DMEM中培养,当细胞生长达到80%融和时,取处于对数生长期的细胞用于实验。实验均分为2组;对照组不加白藜芦醇,处理组中加入不同浓度的白藜芦醇。 1.3细胞增殖测定(1)
5、用0.25%胰蛋白酶将细胞消化制成2105 mL1单细胞悬液,按每孔100 L接种于96孔板,处理组白藜芦醇终浓度分别为12.5,25,50,100,200 mol/L,分别在12,24,48 h各取1块板,换不含血清的培养液每孔100 L,各孔中加MTT 10 L(5 mg/mL),孵育4 h,加入MTT裂解液(10%SDS,5%异丁醇,0.012 mmol/L HCL)100 L,37 孵育18 h后,酶标仪(BioRad 550型,美国BioRad公司)测取D(550 nm)的光密度值,取4 孔平均值。该值反映活细胞数目,即细胞增殖程度。(2)制备2105 mL1单细胞悬液,接种于置于6
6、孔板中的玻片上,处理组白藜芦醇终浓度分别为12.5,25,50,100,200 mol/L。选择48 h作为终止时间,按试剂盒说明书进行。以已知PCNA阳性的乳腺癌细胞作为阳性对照,以PBS代替一抗作为阴性对照。显微镜下观察,计算PCNA标记指数,即计数1 000个肿瘤细胞中PCNA阳性细胞的百分率。 1.4细胞凋亡测定(1)细胞经过同步化后,即无血清培养24 h,再加入10%血清及不同浓度白藜芦醇(12.5,25,50,100,200 mol/L)培养48 h。收集悬浮细胞及贴壁细胞,经2 000 r/min离心5 min,沉淀重悬于PBS 1 mL,400目筛网过滤,取细胞悬 (COULT
7、ER EPICS XL型,美国Beckman Coulter公司)488 nm激发,605 nm检测,每次检测104个细胞。用MultyCycle软件进行DNA含量和细胞凋亡率分析,DNA含量低于G1期二倍体DNA的细胞为亚二倍体细胞。(2)按PCNA检测方法接种细胞,选择3个浓度白藜芦醇(25,50,100 mol/L)作用细胞48 h。按TUNEL试剂盒说明书进行,以DNase处理肿瘤细胞作为阳性对照。显微镜下随机计数200个细胞,计算阳性细胞比率。 1.5细胞侵袭检测 1.5.1细胞黏附试验(MTT法)取96孔培养板,每孔加入FN 20 L(100 mg/L),风干后置4 备用,用PBS
8、洗2次重新水化。2105 mL1浓度的Bel7404细胞悬液加入96孔细胞培养板上,每孔100 L,处理组白藜芦醇终浓度分别为12.5,25,50 mol/L,每组复3孔。置37 、体积分数为0.05的CO2培养箱内,分别于30,60,90 min后,弃去上清液,PBS冲洗2次除去未黏附细胞。黏附细胞用MTT法在酶标仪上测定D(550 nm)值,并计算黏附抑制率: 黏附抑制率(对照组黏附细胞D值处理组黏附细胞D值)/对照组黏附细胞D值 1.5.2细胞运动实验在Transwell小室滤膜的下室面铺上FN 10 L(0.2 mg/mL),超净工作台中风干备用。取1106 mL-1 Bel7404细
9、胞悬液(培养基为0.1% BSA的RPMI 1640),处理组Transwell小室的上室中加入白藜芦醇(终浓度分别为12.5,25,50 mol/L的细胞悬液100 L),下室分别加入用上述培养基制成白藜芦醇溶液600 L,终浓度与上室相同,各组均复3孔。37 、体积分数为0.05的CO2中培养12 h后取出滤膜,甲醇固定,棉签拭去上室面的细胞,常规苏木精伊红(HE)染色。随机于显微镜下取上、下、左、右、中心5个视 野,计数穿膜细胞数。以该细胞数目表示肿瘤细胞的运动能力。 1.5.3体外侵袭实验使用运动实验中的Transwell小室,滤膜的下室面铺上FN并风干后,在小室上室面均匀铺上13 R
10、PMI 1640稀释的Matrigel,置37 培养箱30 min使之凝固,其他步骤同1.5.2,以计数穿膜细胞数目来反映肿瘤细胞降解Matrigel的能力。 1.6统计学处理数据采用SPSS 11.5统计软件包进行分析,各组间比较采用双侧t检验。 2结果 2.1对细胞增殖的影响 2.1.1MTT法作用48 h后,25 mol/L白藜芦醇可抑制Bel7404细胞增殖(P0.01),且对Bel7404细胞的抑制程度随时间延长、剂量增加呈加大趋势,白藜芦醇达到较高浓度(100 mol/L和200 mol/L)时,正常肝细胞L02和Bel7404细胞的生长均受到抑制(P0.01,表1)。 2.1.2
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 藜芦 肝癌 Bel 7404 细胞 增殖 侵袭 影响
链接地址:https://www.31doc.com/p-2765166.html