豆科牧草生物固氮20101017.doc
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1、8.5 豆科牧草根瘤菌的共生固氮玉永雄1 何庆元21西南大学 2安徽科技学院20世纪以来,单位面积上粮食产量的增加很大程度上归功于化肥的施用。近年来氮肥的施用量越来越大,但肥料的利用率却在不断下降,大部分进入地下水,使江河湖泊富营养化。大量施用氮肥,致使土壤板结,降低了土壤的蓄水保墒能力。并且工业氮肥是在高温高压下生产的,消耗大量石油、煤炭等不可再生的能源,同时造成对环境的污染。生物固氮是固氮微生物在常温常压下利用可再生能源(太阳光)固定空气中的氮素,使之能直接被生物吸收利用的过程。生物固氮固氮量大,是工业固氮的三倍,不但可以使农作物增产而且也不会出现对环境的任何污染,同时改善土壤,降解土壤中
2、的毒素,是可持续农业发展的重要措施。因此,加强固氮微生物活动,利用生物固氮获得氮肥,是今后氮素肥料研究的主要方向之一。而共生固氮是生物固氮中最重要的固氮形式,其固氮量占整个生物固氮的一半以上。8.5.1 共生固氮的概念共生固氮是指植物和微生物相互作用,形成共生体系,在这个体系中微生物(小共生体)发挥其固氮活性,使大气中的游离的氮气转化为生物可利用的化合态氮的过程,而植物(大共生体)在此过程中为微生物提供固氮所需的场所、环境和能源,并促进微生物发挥固氮作用。8.5.1.1 共生固氮的类型固氮生物多种多样,除了少数蓝藻外,大多是一些简单最原始的生物。固氮生物一般分为非共生固氮和共生固氮两大类。其中
3、共生固氮是最重要的固氮方式,迄今为止,发现的共生固氮类型大致可分为以下五类:1)豆科共生固氮型:固氮菌为生活在豆科植物根内的细菌,如苜蓿根瘤菌,有近900个种。2)非豆科共生固氮型:生活在非豆科植物根上和根内的菌,如与杨梅、木麻黄等近120种非豆科植物共生的固氮菌,多数为放线菌,也有真菌、蓝藻、细菌、分枝杆菌等。3)联合固氮型:植物根际上的联合固氮微生物进行生物固氮,如生活在植物(水稻、小麦、玉米等)根表和根际的极毛杆菌、酵母、细菌等。4)叶瘤和叶面微生物固氮型:生活在某些植物叶中的细菌(如杆菌、分枝杆菌、蓝藻等)和叶面的固氮菌(如极毛杆菌、酵母、细菌等)进行生物固氮。5) 其他:如菌根(小球
4、菌和放线菌),地衣(多种蓝藻),绿萍(念珠菌)等。8.5.1.2 共生固氮研究的历史回顾和展望1) 生物固氮研究的起步阶段对生物固氮的认识和研究最先是从豆科植物共生固氮开始的。在人们对生物固氮概念尚未明确之前,我国劳动人们在生产活动中,就知道豆科植物能够肥田。公元前三世纪的西晋广志中就有利用苕子和水稻轮作增产的记载。最先从科学上证明生物固氮的是1883年法国农业化学家J.B.Bousinggault根据田间试验和化学分析的结果指出,豆科植物可以从空气中取得氮素营养。1866年俄国学者沃罗宁(M.C.Bopo)最先发现豆科植物根瘤中含有微生物,并指出根瘤的形成是微生物侵染的结果,但他没有把根瘤的
5、形成和豆科植物的固氮作用联系起来,直到1886-1888年德国学者H.Hellreigel等用砂培试验证明,豆科植物只有形成根瘤时,才能固定空气中的氮素。1888年,荷兰学者M.W.Beijerinck证明了豆科植物根瘤是由细菌引起的,并分离纯化获得了根瘤菌纯培养物。接着,波兰学者Prazmowski用根瘤菌纯培养物接种豆科植物,形成了根瘤。2) 生物固氮研究的飞跃发展阶段从20世纪20年代起,生物固氮研究偏重于描述各种生物固氮的类型、形态、分类和固氮菌的生理生态方面。40年代后,则集中在生理和生物化学方面,人们对生物固氮的了解只停留在整体细胞水平上。直至1952年,Stone和Wilson得
6、到固氮菌的无细胞提取液,将研究推进到细胞水平,成为固氮生化的转折点。1974年,英国Beringer等学者发现的R6845质粒在根瘤菌之间推动染色体基因的转移,进一步将根瘤菌的研究推进到共生固氮基因的水平上。20世纪末的几十年中,由于分子生物学和生物化学飞速发展,尤其是酶学在固氮以外的其他方面所积累的大量知识,以及近代物理、化学技术的广泛应用,在固氮酶的分离、纯化、结晶、结构与功能、生物固氮的能量来源、酶促反应及催化机理、电子传递和防氧机制、化学模拟生物固氮等进行了深入的研究,取得了突破性的进展。而20世纪以来,固氮的研究从微观上进一步深入到了分子水平,对固氮基因、结瘤基因以及固氮基因组和竞争
7、结瘤等方面都做了大量的工作,也取得了阶段性的成绩。从宏观上,进一步从生态的角度研究固氮作用,并且加强了对植物与固氮微生物相互关系的研究,植物光能利用率和固氮的关系将作为进一步研究的内容。3) 共生固氮的研究方向和展望目前的共生固氮研究,正围绕着如下几个方面的问题进行:固氮生物资源的进一步开拓利用,固氮微生物的系统分类和遗传地位,现有固氮生物固氮能力的提高,寻找更高效的固氮微生物;固氮微生物的逆境生理,在环境条件胁迫下寻找高效的固氮菌;固氮遗传和遗传工程的研究,利用生物技术改造菌株,提高菌株的固氮能力;其他,如光合固氮及其与氢代谢的关系以及植物固氮相关基因的定位和克隆等。这些研究中,学者们正期待
8、能够实现下面一些美好的愿望:进一步增加已知的植物微生物系统所得固氮量。建立更好的甚至是新的植物微生物共生关系,特别是将根瘤菌转移到其他非豆科植物上,实现固氮作用;将固氮基因转移到不固氮的植物上,使这类植物自己利用大气中的氮自己解决氮素营养问题;发展在常温常压下合成氨等。8.5.2 根瘤的形成、结构与功能豆科植物固氮是豆科植物和根瘤菌相互作用,形成根瘤,由根瘤菌在根瘤内提供固氮活性酶,植物提供固氮所需的环境和能源的相互协作的过程。因此,根瘤菌、植物及其相互作用都能影响共生固氮。根瘤菌和植物的相互识别、相互作用是一个非常复杂的生理、生化过程,涉及到植物和根瘤菌的各个方面。8.5.2.1 根瘤的形成
9、过程豆科植物根瘤的形成是根瘤菌和植物之间对抗和协调的统一,最终成为相互有利的共生关系。但在某些情况下,协调关系不能完全建立,如根瘤菌对豆科植物只是单纯寄生。根瘤形成过程大体上可分为感染,根瘤的发生和根瘤的发育三个阶段。从起源划分,根瘤又分为外生型和内生型两种。外生型的感染局限于皮层的薄壁组织,除维管束以外,根的中柱组织和根瘤的形成无关。内生型根瘤的组织完全是由中柱鞘的再生分化而形成的。1)感染和侵染过程根瘤菌一般通过豆科植物的根毛对植物根部进行感染,也有直接通过细胞壁感染。还有一些植物是由侧根穿过表皮的裂隙部位侵染植物组织内部。而水生的豆科植物则是从表皮层细胞侵染根部。感染形成的根瘤一般有两种
10、类型,一种无限生长型根瘤(如:三叶草、苜蓿、豌豆等),具有顶端分生组织,在根瘤成熟后能继续生长,使根瘤体积增大,以致分叉。另一种是在有限生长型根瘤,没有分生组织,生长发育一段时间后,各部分同时分化成熟,根瘤体积不再增大(如大豆、豇豆、山麻黄、花生等),如图8-1。 无限型根瘤 有限型根瘤图8-1 无限型根瘤和有限型根瘤(引自 李阜棣,2000)根瘤菌和豆科植物相互作用时,首先是豆科植物根系在土壤中生长,刺激相应的根瘤菌向根际移动并大量繁殖。根的这种影响甚至可以达到2-3厘米远的距离。这时,许多根瘤菌吸附在根的表面。这种吸附不是简单的物理过程,而是豆科植物与相应的根瘤菌之间的特定识别作用。其基本
11、过程为:1)植物分泌特异的黄酮或类黄酮物质;2)根瘤菌合成和释放类似几丁质的寡聚多糖(胞外多糖);被称之为结瘤因子;都含有35个糖苷基单位组成的b-1,4-N乙酰葡萄糖胺骨架;在非还原段C-2位上有一脂肪酸链;因菌种不同,两端的其它碳位上具有不同基团,它们决定结瘤作用的特异性;3)如果结瘤因子能够正确识别出黄酮或类黄酮物质,就会激活其它的nod基因,然后这些基因的编码蛋白共同形成结瘤因子;4)植物再识别并确认正确的结瘤因子,这样,结瘤因子就启动了结瘤的早期过程;5)除结瘤因子之外,根瘤菌的胞外多糖可能在以后结瘤过程中(细菌侵染植物细胞)起到重要的识别作用。根瘤菌进入根毛细胞的部位,根毛细胞壁内
12、陷,并开始分泌一种含纤维质的物质,将根瘤菌包围起来,随着根瘤菌向前推进,形成一条管状的分枝或不分枝的纤维素鞘,称着侵染线。在显微镜上可看到根瘤菌在卷曲的根毛壁上形成一个明显的点,并不断膨大。侵染线不断延伸,直到根的内皮层。在适宜的寄主细胞中,侵染线细胞破裂,细菌释放到寄主细胞的细胞质中,然后,每个细菌由寄主植物产生膜包围起来,膜和膜之间留有空隙,可以让植物细胞内氧、氢和二氧化碳等气体,有时包括氨气体通过,以适应生物固氮的需要。根瘤菌侵染线形成和发展过程中,根毛细胞核具有十分重要的作用,如果最初侵染点上没有细胞核,侵染线就不能发育而造成其凋亡。侵染线使根毛生长速率减少7-10 m h-1。McC
13、oys (1932)对紫花苜蓿的研究表明,侵染线在化学结构上与根毛壁是相似的。侵染线的形成频率相当低,在这些侵染线中,根瘤菌分开被包围在一种尚未成型的结构中。这种结构由细菌外多糖和植物糖蛋白组成。侵染线的尖端是开放的。侵染线尖端的封闭会导致其不能形成。Vance (1983)认为,侵染线的根毛细胞壁对试图穿透或机械伤害产生应答性生长,这与对疾病的抵抗反应是类似的。根瘤菌在侵染线内不断繁殖,侵染线也就不断伸长,向根毛基部和表皮细胞推进。每小时约可前进5-8m,1-2天内到达表皮细胞。通常每条根毛有一根或几根侵染线,但只有个别侵染线能够持续发展。当侵染线到达根毛细胞基部的细胞壁时,侵染线壁同细胞壁
14、联接起来,穿过表皮细胞壁向根内推进。侵染线到达根的皮层后就分枝发育,侵染线侵入根的皮层组织的深度随植物种类和入侵位置而异。在大豆主根中,侵染线只能达到皮层第5-6层薄壁细胞;在侧根中,由于皮层细胞的抵抗力较弱,侵染线可直达到中柱鞘细胞层。2)根瘤的发生和发育当侵染线到皮层3-6层细胞时,位于前方靠近内皮层的细胞受到影响,开始分裂,成为根瘤的分生组织。而寄主根部皮层细胞进一步分裂发育增长形成纤维厚壁组织,在外观上凸出到根的表层上,成为“疙瘩”,即所谓的根瘤。不断长大的根瘤分化为外皮层组织和内部组织,并形成维管束与根的维管束接连起来,建立了共生关系。共生开始后,根瘤菌聚集在寄主细胞的细胞质外围,大
15、量繁殖,变成环带状的肿大类菌体。在圆球状有限型生长根瘤中,如Lotus, Glycine, Phaseolus 和 Vigna,结瘤分生组织在外皮层开始。然后,在内皮层细胞也产生分裂。这些分生组织融合,形成初始根瘤体。通过细胞膨大向四周分裂,产生圆球状根瘤。分生组织仅在根瘤发育的早期发挥短期(8-14天)作用。成熟有限生长型根瘤组织没有分生能力。相反,在无限生长型的根瘤里,如苜蓿和三叶草,根瘤分生组织发育是在邻接内皮层的内皮部。无限生长型的根瘤发挥数个月的功能,在有些多年生木本植物里甚至长达数年。并且细胞单向分裂,分生组织分化成为一种杆状。细胞分裂后接着进行细胞扩大,导致形成一种长、圆柱型的根
16、瘤。随着根瘤生长,有些根瘤的顶端区域分化十分频繁,导致产生具有分枝、珊瑚状的根瘤。3)细胞间直接侵染在许多生长在热带和亚热带豆科植物中,没有观察到侵染线。花生、田皂角属(Aeschynomene)的一些种和某些柱花草属(Stylosanthes)的种,仅在侧根突出处发现长有根瘤。又如在田皂角(Aeschynomene indica)和圆锥田皂角(A.pamiculata)存在茎瘤。研究表明豆科植物中存在另一种感染方式。这种方式表现为根瘤菌能够诱发根毛的卷曲与分枝,但这种方式仅发现于侧根突出处。然而,这种根瘤菌的入侵仅限于通过根毛壁和邻接的表皮和皮层细胞间的空间突出处。并且感染仅发生于根毛有膨大
17、基部细胞处。虽然仅仅是被感染的突出侧生根的皮层细胞发育为根瘤,但最初被根瘤菌入侵的是上述根毛着生的膨大基部细胞。根瘤菌侵染宿主植物的感染方式取决于寄主植物,而不是由细菌的基因组所决定。8.5.2.2 根瘤的结构和功能1)根瘤的结构根瘤菌在寄主植物中形成的根瘤分为五个部分:1)由小细胞组成的分生组织,这些小细胞不会被根瘤菌侵染,只能促使根瘤的生长。2)侵染线区域:这一区域的细胞增值很快,被根瘤菌侵染,但并不固氮。3)固氮区域:在寄主植物这部分细胞里充满了根瘤菌,菌体外形膨大,呈各种形状,称为类菌体。这种形态的根瘤菌里含有固氮酶,因此能够固定空气中的氮。固氮酶中含有铁和钼,这两种金属在传递电子中具
18、有重要作用。此区域呈红色或粉红色,是细胞内含有豆血红蛋白的缘故。豆血红蛋白是一种将氧传递给类菌体的红色素,保证固氮所需的无氧或低氧环境,又能满足固氮所需的能量。4)退化区域:呈浅绿色,细胞已经退化,不再固氮。5)维管系统:在中柱的导管中形成,用以为根瘤输送营养物质,把固氮所需的碳水化合物输入根瘤,同时把合成的含氮化合物运送到叶中去。不同类型的根瘤由于生长和发育的方式不一样,其形状和大小不一,无限型根瘤是长、圆柱型的,常象珊瑚状,在根瘤的末端有顶端分生组织。成熟根瘤有三个色区: 1)白色区,它包括根瘤分生组织和侵染线区;2)粉红色区,存在有豆血红蛋白,它是有效固氮的部位,含有不同发育阶段的类菌体
19、(有固氮酶活性的细菌); 3)老根瘤的绿色区,预示根瘤基本衰老。有限型根瘤呈圆形,其单个根瘤内没有太多的分生组织。新形成的小根瘤是白色并含有大量可分裂的细胞,在豆血红蛋白作用下,有的瘤表现出粉红色。衰老的根瘤是绿色或棕色。不同发育时期的根瘤可以在成熟植物任何一个时期内形成。2)根瘤的功能根瘤是固氮作用的场所,根据其不同组份的作用可以分为以下三类功能。第一类是根瘤中固氮作用的能量供应及产物的同化和转运的酶类。根瘤菌的生存、代谢活动和固氮都需要能量。植物地上部分光合作用产物运输到根瘤中,经过代谢产生还原力、ATP和一些代谢产物,供给类菌体中固氮酶进行固氮之用。光合作用每同化100单位碳,就有32单
20、位转运到根瘤中;而类菌体每固定100单位氮,只有6单位保留在根瘤中,绝大部分运送给植物的地上部分,一小部分转送给根系,固氮产物氨输送给植物,为植物合成蛋白质提供原料,同时也防止了氨在根瘤内累积而毒害类菌体中的固氮酶,从而提高了固氮效率。第二类是根瘤色素。根瘤发育形成一定的结构物质,可使根瘤内环境维持在厌氧状态。有效根瘤由于含有一种豆血红蛋白,呈现红色,豆血红蛋白能够为类菌体提供低浓度和高流量的微环境,在根瘤中起调节氧的缓冲剂作用,把多余的氧气送走。因为固氮酶在氧压较高时失活;而为了提供还原作用的能量,类菌体又需要氧进行氧化磷酸化,这样也为ATP形成创造了条件。第三类是与根瘤的固氮效率相关酶类。
21、根瘤中进行的固氮作用和豆科植物的整个新陈代谢结合起来,使这种共生体系的固氮效率比自生固氮体系高很多。自生固氮菌每消耗1克碳水化合物固氮约10毫克,肺炎克氏杆菌约为5毫克,而根瘤菌豌豆共生体系可以达到270毫克。虽然自生固氮菌比活性(即每克细胞蛋白每小时固氮量)比根瘤菌高,但类菌体利用能量的效率高,特别是其固氮周期长,因此,它的总固氮效率显著高于其他固氮体系。一般认为,影响共生固氮有三个方面的因子:1)根瘤的数目;2)在每个根瘤中含菌组织的容积;3)含菌组织固氮持续的时间。在固氮效率上,以往的研究表明根瘤菌存在有效菌株和无效菌株。事实上,根瘤菌的有效性和无效性,不仅与菌株的本性有关,而且也与其共
22、生的寄主植物的种类甚至品种有关。8.5.3 根瘤菌与豆科植物的关系豆科植物共生固氮占整个生物固氮量的1/2以上,而豆科植物是只有和根瘤菌形成的共生关系后,才能固定大气中的氮。大量的研究表明,豆科植物的固氮效率受到寄主、根瘤菌和两者相互作用三方面的影响。不同的根瘤菌株在不同品种的豆科植物上的固氮能力往往不一致。提高固氮效率的关键在于有一个使高效根瘤菌进入同时又有拒绝土壤中大量无效或低效根瘤菌的分子识别系统。而与豆科植物根瘤菌共生固氮有关的基因涉及根瘤菌基因和宿主基因,根瘤菌基因有结瘤基因(nodD、nodABCIJ和hsn基因),根瘤菌细胞表面结构基因(exs、lps和ndv基因)和固氮基因(n
23、if、fix基因 )和结瘤效率基因(nfe);宿主基因主要是结瘤素基因(ENOD和NOD基因)。根瘤菌结瘤基因表达后诱导产生结瘤因子,在根瘤发育过程中,这些基因在根瘤菌与植物之间进行着信息交换,并且具有不同表达水平的结瘤因子和植物激素对它们进行着调节。8.5.3.1 根瘤菌与豆科植物的互接种族关系根瘤菌的突出特点是能够进入豆科植物的根内,在其中繁殖并形成根瘤,同时能利用分子态氮作为氮素营养。根瘤菌的各个菌株只能感染一定的豆科植物。有的菌株只能感染一种豆科植物;而有的可以感染多种豆科植物。不论是何种根瘤菌,在与豆科植物根系上形成的根瘤上,根瘤菌对寄主植物的感染性具有专一性和有效性。由于根瘤菌与豆
24、科植物的共生固氮特点以及这种共生关系的重要农业意义,在根瘤菌的研究中,包括根瘤菌的分类学的研究,始终与研究它们和豆科寄主的关系联系在一起。根瘤菌在豆科植物根上形成根瘤的专一性,构成了“互接种簇”关系。在同一互接种簇内的植物,一般可以为本接种簇内的根瘤菌交叉感染形成根瘤,而不同互接种簇之间,则不能互接形成根瘤。目前对互接种簇的确切概念在看法上也有分歧。尽管如此,下面所列的豆科植物与根瘤菌互接种簇的分类,一般能为人们所接受。属于快生型根瘤菌类的可分为:1)紫花苜蓿簇:包括草木樨、紫花苜蓿、胡卢巴属在内。其共生菌为苜蓿根瘤菌;2)三叶草族:共生菌为三叶草根瘤菌;3)豌豆族:包括豌豆属,蚕豆属,刀豆属
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