浙江大学-刘振伟教授高级培训班-膜片钳技术数据处理与分析.ppt
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1、Clampfit 10 膜片钳实验数据的处理与分析,2014年4月23-25日 杭州 浙江大学,膜片钳技术高级培训班,刘振伟,一、膜片钳实验数据的处理 二、全细胞记录数据的分析 三、单通道记录数据的分析 四、突触放电活动数据的分析,2,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,内容,3,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,一、基线的调零 二、坏点的去除 三、滤波 四、数据文件内部/之间的数学运算,4,Patch clamp training class,Apr. 23-25,
2、 2014,膜片钳实验数据的处理,一、基线的调零,基线的确认 全细胞记录基线易确认,单通道记录基线不易确认。 单通道开放时间较长 所记录的时间较短 同时开放的通道数目较多且长时间持续开放 确定通道电流的方向:电流方向向上,最负向是基线位置,反之亦然。 如何确定:膜片两侧液体、钳制电位,5,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,6,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,基线不在零点的原因 封接电阻的改变:漏电流 失调电位的存在:偏移、漂移 噪声的干扰:交
3、流干扰 高通滤波的影响:对记录线的起始部位产生影响,7,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,基线调零方法 打开Analyze/Adjust/Baseline (1)Subtract mean of(去除均值法):适用于去除直流偏移。 (2)Subtract slope of(去除斜率法):适合于去除持续线性漂移。 (3)Subtract fixed value(去除固定值法):适用于去除直流偏移。数值有正负之分。 (4)Adjust manually(手工调零法):适合于单通道电流的基线或基线漂移无规律。,8,Patch
4、 clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,Epoch A段,(1)Subtract mean of(去除均值法)(2)Subtract slope of(去除斜率法),9,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,(3)Subtract fixed value(去除固定值法) (4)Adjust manually(手工调零法),10,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,基线调零的注意事项 (1)有
5、些只相对值(如电流幅度的变化值),不需要将基线调零。但多数情况需要基线调零,建议都要进行基线调零。 (2)对于基线变动复杂的数据,基线调零可能会用到上述的几种方法。 (3)对于某些基线变动,Clampfit中的基线调零方法可能也无法准确调零。建议最好在采集数据时就设法调整好基线。,11,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示基线调零方法,12,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,二、坏点的去除,坏点产生的原因 刺激伪迹:给标本施加刺激时产生。 电容瞬变
6、电流:电容的充放电反应。 瞬时脉冲干扰(Glitch):打开电源开关(日光灯、仪器设备开启时) 手机来电:一过性高频。 人手靠近记录探头:高幅、高频。,膜片钳实验数据的处理,13,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,坏点的赋值 (1)Data value at cursor 1:Cursor 1的数值。 (2)Mean between cursor 12:Cursor 1-2之间均值。 (3)Mean between cursor 34:Cursor 3-4之间均值。 (4)Straight -line fit between cursor
7、12:Cursor 1-2之间的直线拟合值。 (5)Fixed value(pA/mV):输入一个固定的数值。,膜片钳实验数据的处理,14,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示去除坏点,15,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,注意事项 (1)坏点太多时,应在记录前予以去除。 (2)坏点持续时间短,如果出现持续时间较长的坏点,则数据要废弃。,膜片钳实验数据的处理,16,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 20
8、14,三、滤波,信号采集前的滤波 全细胞通道电流记录:1-2 kHz 全细胞突触活动记录:10 kHz 单通道电流记录:10 kHz 动作电位记录:10 kHz,膜片钳实验数据的处理,17,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,信号采集后的滤波,膜片钳实验数据的处理,18,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,Lowpass,Highpass,Bandpass,Notch,Electrical Interference,Clampfit滤波类型,膜片钳实验数据的处理,19,Patch clamp
9、 training class,Apr. 23-25, 2014,Lowpass 最为常用。 Clampfit根据采样定理与Nyquist定理自动算出f-3dB范围并显示在该框底部。 7种类型: (1)8-pole Bessel:数据失真小,普遍用于时域数据。 (2)Boxcar:数码滤波器,用于时域数据。当前数据点及其前后一些数据点(取决于Smoothing points,取3-99中的奇数)的平均值赋予当前数据点,完成滤波。 Smoothing points值越大,数据幅度削减越大。 (3)Gaussian:数码滤波器,同Boxcar,但当前数据点在平均值中所占的比例较大。 (4)RC (
10、8-coincident-pole):用于时域数据。 (5)RC ( single-pole):用于时域数据。 (6)8-pole Butterworth:用于频域数据。 (7)8-pole Chebyshev:用于频域数据。,膜片钳实验数据的处理,20,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示Lowpass滤波,21,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,Highpass 又称交流耦合(AC Coupling),可削弱低频信号而通过高频信号。 Clamp
11、fit提供两种:8-pole Bessel,单极RC 采用- f-3dB ,Clampfit自动计算出f-3dB范围并显示在该框底部。 最常见的是在神经元上进行细胞内记录时使用高通滤波器,它可降低膜电位的低频振荡对突触电流的干扰。,膜片钳实验数据的处理,22,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示Highpass滤波,23,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,Bandpass 相当于低通滤波与高通滤波的交叉,需要同时设定高通滤波与低通滤波。 高通滤波的
12、f-3dB不能高于低通滤波的f-3dB 。 带通滤波用于欲记录的信号频率较为单一和固定时,对其它频率的噪声进行滤波。,膜片钳实验数据的处理,24,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,Notch 带阻滤波:削弱某一特定频率(如50 Hz交流)信号。 中心频率(Center frequency):10-3,000 Hz。 频率宽度(3dB width):频率宽度。 -3dB width越窄,滤波需要的数据点越多,滤波效果越好。,膜片钳实验数据的处理,25,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片
13、钳实验数据的处理,Clampfit演示Notch滤波,26,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,Electrical Interference(EI) 电干扰滤波器(Electrical interference filter, EI)为数码滤波器。 可同时去除50 Hz及其谐波(100 Hz、150 Hz等)的复杂交流噪声。 Harmonics from 1 to:用于设定欲去除的交流谐波的最高数目,最大数目为20(对应于1 kHz),一般去除第1-3个就够了。 Cycles to average:数目越大,-3dB频率宽度越窄,滤波效果越
14、好,但需时越长。 Reference frequency:选50 Hz。,膜片钳实验数据的处理,27,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,EI所需最少数据点的计算举例 滤波器所需最少数据点 (采样频率/ 50 Hz) Cycles to average 若采样频率 10 kHz, 则一个50 Hz正弦波周期的采样点数 10 kHz / 50 200 点 若设定Cycles to average 10,则需要的最少采样点数 2,000点 采样数据点不够的话,将不能清除谐波干扰。,膜片钳实验数据的处理,28,Patch clamp trainin
15、g class,Apr. 23-25, 2014,四、数据文件内部/之间的数学运算,Analyze/Average Traces 平均文件内任意几条相同的Trace,获得平均后的一条Trace。 要求: Clampex软件的Fixed-length events、Episodic stimulation和High-speed oscilloscope模式。 重复记录的信号,时程必须固定不变。,膜片钳实验数据的处理,29,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,降低信号噪声 信号频率谱与噪声频率谱一致或有重叠时,滤波不行。 平均Trace的原理:设
16、有N条Trace,则(见表): 先累加所有N条Trace, 此时信号幅度增大为原来的N倍,而噪声却只增大为原来的N倍。 然后再除以Trace条数N, 信号幅度不发生大的变化,而噪声幅度却降低为原来的1/N。,膜片钳实验数据的处理,30,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示Average Traces功能,31,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,Analyze/Segmented Average 可对几个Trace中的某一相同时段(如Epoch A)
17、或Cursor 1-2之间的时间段进行平均,平均后的文件通常用于Analyze/Subtract Control功能中的Control File。,膜片钳实验数据的处理,32,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,Analyze/Arithmetic 对文件内的任何Trace进行加减乘除等运算,使原来的Trace得到新值。 如t3=t1+t2,t3=2t1+3t2 Results窗口中的该功能可对不同Column的数据进行运算,得到新的Column的数值。,膜片钳实验数据的处理,33,Patch clamp training class,Apr
18、. 23-25, 2014,Analyze/ Average Files 对几个文件进行平均。 例如在进行相同的实验时,需要将几个采样文件相应的每一个Trace进行平均。平均后的文件会自动生成,文件名为Average000-999.abf。 仅适用于Episodic Stimulation、High-speed oscilloscope模式的数据;Protocol设置必须一致。 同样具有降低噪声的作用。,膜片钳实验数据的处理,34,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示Average Files功能,3
19、5,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,Analyze/ Subtract Control 两个文件中所有相应的Trace进行相减,可用于去除漏电流或分离某种通道电流。 要求两个文件要采用相同的Protocol来采集(信号数目、Sweep数目与长短、信号单位、采样频率)。 Test file为“大”文件“被减数”,Control File为“小”文件“减数”。 Multiply control traces by: 将Control File中的Trace乘以该倍数,然后再从Test file中减除。,膜片钳实验数据的处理,36,Patch
20、clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示Subtract Control功能,37,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,注: 如需要,可用Analyze/Data Reduction或Interpolation功能使采样频率变为一致。 若Test file中的Signal或Sweep数少于Control file,后者多余的Signal或Sweep将不被使用。反之,若Test file中的Signal或Sweep数大于Control file,后者最后一个Signa
21、l或Sweep将被反复使用。 若Test file中的Sweep长度小于Control file,后者Sweep中多余的点将不被使用。反之,若Test file中的Sweep长度大于Control file,后者Sweep中最后一个点将被反复使用。,膜片钳实验数据的处理,以Test file为准,38,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,Analyze/Concatenate Files 将在同一条件下获得的数据文件并成一个文件。同一条件是指相同的采集模式/采样频率/采样时间/信号个数 连接后的文件会自动生成: Concatenate000-
22、999.abf。,膜片钳实验数据的处理,39,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜片钳实验数据的处理,Clampfit演示Concatenate Files功能,40,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,全细胞记录数据的分析,一、离子通道的激活曲线 二、离子通道的I-V曲线 三、离子通道的衰减 四、离子通道的失活曲线 五、量效曲线,41,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,膜两侧电压差Vm改变,激活离子通道,用激活曲线描述。 反映通道开启
23、的速度及难易程度。,全细胞记录数据的分析,一、离子通道的激活曲线,42,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,给予细胞一系列脉冲电压来记录全细胞电流,作通道的激活曲线: X轴脉冲电压Vm Y轴全细胞通道电导g/gmax Boltzmann方程拟合,全细胞记录数据的分析,43,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,g:全细胞通道激活电导 gmax:全细胞通道最大激活电导 Vm:不同的去极化(或超极化)脉冲电压 V1/2:通道激活50%时的脉冲电压 k:斜率因子(反映激活速度快慢,k越大,激活速度越
24、慢),全细胞记录数据的分析,Boltzmann方程,44,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,设: f(V) = g Imax=gmax=1 Vmid=V1/2 V=Vm Vc=k C=0 则即为前述的激活曲线方程:,全细胞记录数据的分析,Clampfit中的Boltzmann方程:Boltzmann, charge-voltage方程,45,Patch clamp training class,Apr. 23-25, 2014,先对数据进行处理(如基线调零、滤波、选择用于分析的Sweep数目等)。 测量不同去极化脉冲电压下全细胞电流的峰值I
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- 浙江大学 刘振伟 教授 高级 培训班 膜片 技术 数据处理 分析
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