艾滋病、梅毒实验室检测.ppt
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1、艾滋病、梅毒实验室检测方法及生物安全,高金亮 博士 分子生物学主任技师 鄂尔多斯市疾病预防控制中心 2013年1月15日,艾滋病,即获得性免疫缺陷综合症(acquired immune deficency syndrome, AIDS)。是人类因为感染人类免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)后导致免疫缺陷,并发一系列机会性感染及肿瘤,严重者可导致死亡的综合征。目前,艾滋病已成为严重威胁世界人民健康的公共卫生问题。,艾滋病,艾滋病的发现,美国1981年首先发现5名同性恋中患卡氏肺孢子虫肺炎,数月后又在另外数例同性恋中发现卡波济氏肉瘤,相同的情况也出现在
2、静脉吸毒人群中。均有免疫功能减退,主要是CD4+T细胞的数减少。称为获得性免疫缺陷综合症。同年6月5日美国CDC最先向全世界报道AIDS。 1983年,美国马里兰大学Robert Gallo等从艾滋病病人体内分离到一种与人类T淋巴细胞白血病病毒(HTLV)非常相似的病毒,遂将该新发现的病毒命名为人类T淋巴细胞白血病III型病毒(HTLV-III)(Science 220 (4599): 865867)。与此同时,法国巴斯德研究所的 Luc Montagnier 等从一颈部淋巴结肿大、体质虚弱的艾滋病患者体内分离到一种病毒,该病毒的核心蛋白与HTLV-I 的免疫学特性不同,遂将该病毒命名为淋巴腺
3、病相关病毒(LAV) (Science 220 (4599): 868871)。后经证实这两种病毒为同一种病毒,于1986年将该病毒更名为HIV。同年在非洲发现异性间传播并发现HIV-2。,WHO报告2010年全球约有3400万人感染HIV,新感染270万,全年死亡180万人。每天有超过7000人新发感染。世界各地区均有流行,但97%以上在中、低收入国家,尤以非洲为重。,在2011年年底各国青壮年(15-49岁)艾滋病的流行程度估计,艾滋病流行状况,2008年底各国艾滋病患者及HIV携带者人数估计,1、发现:1985年,一位美籍阿根廷青年以旅游者的身份进入中国,不久便因发烧、肺部感染住进北京协
4、和医院,因该患者对各种抗感染类药物均没有作用,随后进行的血清检测发现其HIV呈阳性。 2、流行现状:中国CDC估计,截止至2011年底,我国存活HIV携带者及艾滋病患者约78万人,全年新发感染者4.8万人,死亡2.8万人。疫情已覆盖全国所有省、自治区、直辖市,目前我国面临艾滋病发病和死亡的高峰期,且已由吸毒、暗娼等高危人群开始向一般人群扩散。2009年疫情估计结果显示,云南、广西、河南、四川、新疆、广东等6省HIV感染者超过5万人,占全国估计总数的61.8%;15万人的省份有9个;5千人以下的省份有8个,占全国估计总数的2.3%。累计报告艾滋病病毒感染者和病人数排在后7位的省份是西藏、青海、宁
5、夏、内蒙、天津、甘肃、海南,报告人数不到全国报告总数的1%。,中国AIDS流行情况,病原学,1、病原体 AIDS的病原体是人类免疫缺陷病毒(HIV)。HIV属于反(逆)转录病毒科,慢病毒属人类免疫缺陷病毒组。 2、病毒形态结构 HIV呈球形或椭球形,直径100-120nm 电镜下成熟的HIV-1呈现一致密的圆柱状核心和一个病毒包膜。 外层为类脂质包膜,膜上为突起插入,突起由糖蛋白(gp120)和跨膜蛋白(gp41)以共价键连接而成。 病毒核心由病毒RNA、逆转录酶、整合酶和蛋白酶,有核心蛋白p24、P6、P9包裹 HIV的RNA为两条相同拷贝(完全同源)的正股RNA链。,HIV的形态,HIV的
6、逆转录酶缺乏35核酸外切酶活性 ,无法修复逆转录和复制过程中发生的错误 。,HIV颗粒,3、HIV的基因结构及分型 HIV可分为HIV-和HIV-两型。HIV-1全长9181bp, HIV-2全长10359bp. (1)基因组成: HIV含3个结构基因和6个调节基因 : LTR-gag-pol-vif-vpr-tat-rev-vpu-env-nef-LTR. : LTR-gag-pol-vif-vpx-vpr-tat-rev-env-nef-LTR. (2) 两者的主要区别: 型含有vpu,而型含vpx。 vpr和nef与其他基因的关系也不同: A HIV-的vpr与vif相互重叠,而nef与
7、env不重叠; B HIV-的vpr与vif不重叠,而nef与env相互重叠。 (3)结构基因表达产物 HIV- HIV- 包膜蛋白基因env:gp160 gp120 gp41 gp140 gp105 gp36 群抗原基因gag: p55 p24 p18 p56 p26 p16 多聚酶基因pol: p65 p51 p31 p68 p53 p34,HIV感染机理,HIV病毒侵入人体后,其表面糖蛋白gp120与细胞表面受体蛋白CD4以高亲和力结合,吸附到宿主细胞上;gp120再与宿主细胞表面辅助受体相互作用,使病毒与宿主细胞膜更接近;gp41产生一系列构象变化,其N端的融合肽片段插入宿主细胞膜,导
8、致病毒包膜与细胞膜的最终融合,病毒RNA进入细胞。,HIV-1通过gp120与靶细胞表面CD4分子和趋化因子受体结合,HIV辅助受体gp120与CD4特异受体结合细胞内两条病毒RNA链逆转录酶逆转录成单链DNADNA聚合酶复制。一部分装配成HIV ,以芽生方式释出,再感染其它细胞。一部分与宿主的DNA整合,成为潜伏状态的前病毒。,艾滋病的传播途径,HIV主要存在于HIV感染者/艾滋病患者的体液中,包括血液、精液、阴道分泌液、乳汁、伤口渗出液等。任何能够引起体液交换的行为,都有传播HIV的可能。,三种传播途径 1、性传播:通过异性或同性性行为传播。 2、血液传播: a.通过共用注射器或针头注射毒
9、品; b.通过输入含有HIV的血液或血制品; c.使用未经消毒或消毒不严格的医疗器械(如针头、针灸针、牙科和美容器械等) d.通过共用剃须刀(刮脸)及牙刷等传播; 3、母婴传播:通过胎盘、产道和哺乳传播。,HIV对环境中理化学因素抵抗力均较弱,比HBV的抵抗力低得多。 对HBV有效的消毒和灭活方法均适用于HIV。 HIV对热很敏感,对低温耐受性强于高温。因此,可以用高温灭活病毒,在低温条件下保存病毒。 在室温(2227)液体环境下HIV可存活15天以上;经56处理30 min可使HIV在体外对人的T淋巴细胞失去感染性,但不能完全灭活血清中的HIV;经过60 3小时或80 30min作用后不能检
10、出感染性病毒。 HIV耐碱不耐酸 室温中0.5%次氯酸钠或75%酒精只需1min即不能检出RT酶活性; 0.2%次氯酸钠、0.1%家用漂白粉、0.1%戊二醛等5min即可灭活; 30%酒精溶液5min、20%酒精溶液10min可灭活HIV。 对紫外线不敏感,离开人体可存活数小时至数天。,病毒生物学特性,实验室检测,艾滋病和艾滋病病毒感染诊断标准WS298-2008 全国艾滋病检测技术规范(2009年修订版) 全国艾滋病检测工作管理办法卫疾控发2006218号,依据,检测目的,1.临床诊断 2.安全输血 3.流行病学调查、高危人群监测 4.自愿咨询检测VCT 5.抗病毒治疗后效果检测 6.抗病毒
11、治疗耐药性检测 7.免疫功能测定,艾滋病诊断的特殊性,高度依赖实验室诊断 HIV检测的严肃性: 保证输血、器官移植的安全 错误结果将导致严重的法律问题 结果严格保密,HIV检测实验室及管理要求,检测工作必须在经批准的艾滋病实验室内进行。未设置艾滋病实验室的机构或单位及未经备案或批准的艾滋病实验室不得开展相关的艾滋病检测工作。 国家对艾滋病检测实验室实行分类管理,按照实验室的职能、开展检测工作的性质及范围共分三类实验室,分别是艾滋病参比实验室、艾滋病检测确证实验室、艾滋病检测筛查实验室(包括:艾滋病筛查中心实验室、艾滋病筛查实验室和艾滋病检测点) 。 必须立即开展或已经开展艾滋病检测工作而又暂时
12、不具备艾滋病筛查实验室设置条件的单位,作为一种过渡,可以暂时设立“艾滋病检测点”。“艾滋病检测点”也必须达到安全防护的基本要求,并经省(自治区)卫生行政部门批准和备案。,艾滋病实验室的仪器设备应能满足安全防护要求。使用国家规定需要强检的仪器设备,必须由同级计量认证部门定期检定,非国家强检的仪器设备应定期维护和校准。 艾滋病检测工作中所使用的检测试剂,必须使用经国家食品药品监督管理局注册、中国药品生物制品检定所“批批检”合格,且在有效期内的试剂;推荐使用经临床质量评估敏感性和特异性高的试剂;严格按试剂盒操作说明书操作。 从业人员需经过培训,持证上岗。,1.艾滋病实验室应对所使用的艾滋病检测试剂实
13、施定期监测,以保证检测试剂的稳定性。 2.艾滋病检测过程中,应严格按试剂操作说明书操作,作好质量控制。遇到疑难情况应报上一级实验室帮助解决。 3.按照全国艾滋病检测技术规范要求,作好实验记录、档案管理和保存工作。 4.每年参加省疾控中心艾滋病确认中心实验室或其委托的初筛中心实验室对各艾滋病实验室进行的室间质量考评。,质量控制和室间质量考评,BSL 实验室设计和建造的要求: 应有专门放置生物废弃物容器的台(架)。 应设置实施各种消毒方法的设施,如高压灭菌锅、化学消毒装置等对废弃物进行处理。 应设置洗眼装置。 实验室门宜带锁、可自动关闭。 实验室出口应有发光指示标志。 生物安全柜,HIV抗体检测(
14、筛查和确证)、抗原检测、相关免疫学检测、HIV核酸提取和检测、HIV阳性样品的保存均应在生物安全级实验室(BSL )内进行。 凡涉及活病毒的研究工作(如病毒分离培养、浓缩、中和试验、细胞培养、病毒保存)均应在生物安全级实验室(BSL )内进行。,HIV相关检测的生物安全级别,初筛实验室设计和建造的要求: 有专用实验室(至少专用检测台),应划分清洁区和污染区,并有明显标记,有充足的操作空间。 实验室墙面、地面、台面材料应来耐酸、碱、易清洁消毒、不渗漏液体;室内应有防蚊、防蝇、防鼠等设备 检验台上应装置紫外灯。 备有消毒药品、消毒器材和消毒设备。 有感应流水装置,备有冲眼睛水,足够的一次性手套、口
15、罩、隔离服和防护眼镜。 (6) 实验室应装置恒温设备,室温为2025。,HIV感染后体液变化 感染HIV后,机体针对HIV的抗原性物质产生相应抗体,在临床上具有重要诊断学意义的抗体由gpl60,gpl20,gp41,p66,p55,p51,p31,p24,p17等 抗原诱导产生。 不同个体对各种抗原的免疫应答有一定的差别(时间、强度等) 检测方法和使用试剂的敏感性不同对HIV抗体的检出时间产生一定影响。在感染HIV后,最先能够监测到病毒RNA、然后是p24抗原,继之,各种HIV抗原可达到高峰;2-6周后,随着HIV-l抗体产生及浓度的不断增加,HIV抗原渐趋降低或检测不出。,窗口期的问题?抗体
16、通常是在感染后38周能够被检测出来。95%在三个月可以检测出抗体。 在窗口期,病毒抗体不能被检出,但可以检测到病毒相关抗原或分离病毒。抗原能够在个体感染后先于血清转化218 d被检测到。因此,在血清转化期通过检测p24抗原作为早期辅助诊断HIV感染的一种方法。,HIV感染后的血清学改变,HIV感染的实验室检测方法,常用HIV病原学检测方法: 1. 核酸检测( cDNA测定-PCR、 RNA测定-病毒载量) 2. 病毒培养分离 3. P24抗原检测 常用HIV抗体检测方法: 初筛:1.酶联免疫吸附法 ELISA:第三代、第四代 2.快速检测 RT:金标、硒标 3.简单法 PA: 明胶颗粒凝集 确
17、证:免疫印迹法 WB:(Western Blot) 其他相关检测方法: 免疫功能测定:CD4/CD8检测 各种分子生物学技术,(一)HIV核酸检测,通常使用PCR或RT-PCR技术,用于HIV感染的辅助诊断。,核酸检测特点,用于检测不能培养和分离的病毒(如HBV、HCV、HIV等); 仅需少量标本或标本中仅含少量病毒; 能在病毒感染的急性期抗体尚未出现之前做出诊断; 可对病毒进行定量检测,有助于疗效监测; 可对病毒进行基因分型,比血清分型更有价值; 对病毒的耐药基因进行检测,可预测或发现病毒的耐药性; 可用于先天性或围产期获得性病毒感染的诊断; 灵敏度高(可达ng甚至fg水平,理论上能检出单个
18、病毒基因),特异性好、快速、简捷。,核酸检测主要应用,1) 早期诊断围产期HIV感染的辅助诊断: 宫内感染(检测定义): 新生儿出生48小时内,检测到病毒核酸,或病毒培养阳性,则提示孕期(宫内)感染。 对围产期感染儿童在18月龄前的早期诊断,目前以2次核酸检测结果作为辅助诊断的依据。2次不同时间的样本核酸检测均为阳性提示为HIV感染,均为阴性提示未感染。同时18个月时做抗体检测,当18个月HIV抗体确证阳性方可诊断 HIV感染。,核酸检测主要应用,2)对18个月婴儿HIV抗体WB试验的不确定(或可疑)结果进一步做辅助诊断; 3)在HIV抗体未产生之前(窗口期)辅助诊断急性原发感染; 4)HIV
19、亚型分析;确定人群中HIV的变异; 5)监测临床抗病毒药物治疗效果; 6)检测病毒的耐药性突变。,(二)HIV病毒分离培养,将病人淋巴细胞与正常人的淋巴细胞共同培养,适当周期培养后测定培养液HIV p24抗原/RT,从而判断病人的淋巴细胞是否受到HIV感染。 细胞培养与血清学方法相比,专一性很强,不会出现假阳性。但其敏感性不如血清学或PCR。 必须在P3级生物安全实验室进行。,HIV病毒分离培养的应用,1.能得到最原始的临床毒种,其重要意义在于确认对WB不确定的可疑感染者及母婴传播、婴幼儿HIV感染者。对法律纠纷或职业暴露明确毒主株亲缘关系。 2.毒株可用于抗病毒药物筛选,耐药性及其生物学特性
20、等研究。 3.用定量细胞培养法可测定细胞的半数感染单位(TCID50)和半数抑制药物浓度(IC50)用于抗病毒药物测定。或消毒杀菌药品的效果评价。 本法一般不用于常规诊断。,(三)HIV p24抗原测定及适用范围,是一种血清学夹心法EIA。 (1) HIV-1抗体不确定或窗口期的辅助诊断。 (2)HIV-1抗体阳性母亲所生婴儿早期的辅助诊断。 (3)第四代HIV抗原/抗体ELISA试剂检测呈阳性反应,但HIV-1抗体确认试验呈阴性者的辅助诊断。 (4)监测病程进展和抗病毒治疗效果。,HIV-1 P24抗原检测结果报告和解释:,(1)HIV-1 P24抗原的阳性结果必须经过中和试验确认。 (2)
21、HIV-1 P24抗原阳性仅作为HIV感染的辅助诊断依据,不能据此确诊。 (3)HIV-1P24抗原阴性结果只表示在本试验中无反应,不能排除HIV感染。,(四)HIV抗体检测,检测抗-HIV抗体是HIV/AIDS诊断的一项重要指标,抗-HIV抗体测定作为血清学诊断要求准确、可靠,必须经初筛、复检试验和确认实验三个步骤。 初筛实验方法主要有:酶联免疫试验(ELISA)、明胶颗粒凝集试验(PA)、快速免疫(层析或渗滤)试验(RT)。 确认试验主要用免疫印迹试验( WB)。,HIV抗体筛查检测流程图,快速检测(RT),胶体金快速试验 金标纸条采用双抗原夹心法免疫测定原理,选择经纯化的基因工程制备的g
22、p36、gp41、p24抗原作为包被抗原和gp41、gp36基因工程抗原和p24合成肽作为胶体金结合抗原。 当待检标本中含有HIV抗体时,先和金标记抗原结合,由于层析作用反应复合物沿硝酸纤维膜向前移动,当遇到包被抗原时,形成Ag-Ab-Ag-Au复合物而富集在包被线上,形成红色沉淀线。同时在包被膜上还有一条质控线对照,故当有两条红线时判为阳性,只有一条红线时,判为阴性。 该方法试剂稳定,可室温长期保存。试验时不需任何设备,迅速、简便、特异性较好,敏感性约相当于中度敏感的ELISA,适用于应急检测、门诊急诊个体检测,尤其是基层单位。缺点:肉眼判断较主观、价格较贵、结果不易保存。,样本要求,1.采
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