2019蛋白组学在肾脏病研究中的应用.ppt
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1、蛋白组学在肾脏病研究中的应用,上海交通大学医学院附属瑞金医院肾脏科 王伟铭,前言,肾脏病的治疗进展缓慢 细微的组织病理学:早期诊断、预后追踪以及疗效观察 尿液:与泌尿系统之间存在着天然的联系,使得尿液在反映泌尿系统功能方面具有“地理”优势 体外的肾活检,蛋白组学与肾脏,PubMed: 关键词:proteomics or proteome or proteomic together with kidney or renal or urine or urinary 2010.11.1:过去5年 1156 篇 解决临床及基础问题的途径,内 容,蛋白组学技术 蛋白组学与肾脏病研究,蛋白质组和蛋白质组学
2、,蛋白质组(proteome):细胞、组织或机体在特定的时间和环境中基因组所动态表达的蛋白质。 蛋白质组学(Proteomics):以蛋白质组为研究对象,在蛋白质水平上定量、动态、整体地研究生物体,并在此基础上对疾病发病机理、预后判断等方面进行探索 从整体的角度,分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态,了解蛋白质之间的相互作用与联系,揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律的一个新的研究领域,Proteomics includes not only the identification and quantification of proteins, but also the deter
3、mination of their localization, modifications, interactions, activities, and, ultimately, their function.,Nephrol Dial Transplant (2010) 25: 1116,研究过程:蛋白质分离、鉴定以及信息资料分析处理三部分,蛋白质组学重要工具,1.蛋白质的分析分离技术。 2D-SDS-PAGE:应用最为广泛 1D-SDS-PAGE 高效液相层析(HPLC) 等电聚焦(IEF) 毛细管电泳(CE) 离子交换液相层析(LC) 反向(RP)-HPLC串联。,Two-dimensi
4、onal Gel Electrophoresis,Cut out Spots and Identify Proteins by Tandom Mass Spectroscopy,2.质谱(MS)技术: 蛋白质 肽的精确质量测定 对肽序列进行分析,质谱技术,Mass spectrometry-based proteomic technologies 基质辅助激光解析电离质谱(MALDI-MS):利用基质吸收激光的能量使得固相的多肽样品离子化 电喷雾电离质谱(ESI-MS):在喷射过程中利用电场完成多肽样品的离子化,表面增强激光解吸电离飞行时间质谱(surface enhanced laser d
5、esorption ionization time-of flight mass spectrometry, SELDI-TOF-MS) 通过测量肽段离子相关参数,如飞行时间(TOF),即可计算得到准确的肽段质量,质谱技术,Four different types of MS-based proteomic technologies (a) 2DE-MS; (b) SELDI-MS; (c) LC-MS; (d) CE-MS,Four different types of MS-based proteomic technologies (a) 2DE-MS; (b) SELDI-MS; (c)
6、 LC-MS; (d) CE-MS,不同蛋白质组学技术的比较,多维液相色谱-质谱技术,通过相对和绝对定量的同位素标签试剂(iTRAQ),还可以用质谱进行蛋白质的定量分析。 ICAT技术是指采用同位素标记多肽或蛋白质的亲和标签技术(isotope coded affinity tags,ICAT) 可以较准确的鉴定出不同状态细胞或组织中差异表达的蛋白质 质谱技术还可以用于鉴定蛋白质复合物组成、确定蛋白质翻译后修饰的类型与发生位点等,新技术,Agilent HPLC-Chip II,是高通量、微型化和自动化为特点的蛋白组学检测技术。能同时从微量的样品中检测多种蛋白质或多肽,用于分析差异表达的蛋白质
7、及药物靶标的鉴定。,数据分析data mining,蛋白质组研究中的生物信息学 蛋白质氨基酸序列(sequence)数据库 蛋白质结构域与家族数据库 蛋白质高级结构及分类数据库 蛋白质2DE图谱数据库 蛋白质相互作用数据库,内 容,蛋白组学技术 蛋白组学与肾脏病研究,尿蛋白质组,Davis 和Spahr(2001) :尿蛋白质组研究的早期开拓者 用LC-MS/MS 方法分析了酶切后的混合尿样,共鉴定出124 个蛋白。 Thongboonkerd (2002):第一张人尿蛋白质组2D 图 67 种蛋白及它们的异型体 蛋白大部分是尿液中的高丰度蛋白 由病变组织漏出、分泌、裂解而释放出的生物标志物很
8、多都是低丰度蛋白,尿液标本的准备,标本收集: 空腹晨尿或中段尿 标本处理:蛋白测定 乙醇沉淀ethanol precipitation 真空浓缩vacuum centrifugation 微浓缩microconcentration 反相捕获柱reverse phase trapping column 标本储存:70或 20,稳定性/差异性,尿蛋白质组在个体间存在着明显的差异 由于锻炼、饮食、生理节奏等因素的影响,同一个体不同时间段的尿蛋白质组也会发生改变 尿蛋白组随时间发生变化,晨尿较其他时间点包含更多蛋白点 不同天内所得尿蛋白组间较同一天内不同时间点间差异更大,稳定性/差异性,个体间较个体内
9、存在更明显的差异 早期小样本试验得到的候选标志物必须经过大样本的验证,才能确定哪些蛋白的变化真正是由疾病导致的,而并非生物学上的变异造成的,糖尿病肾病,Bellei et al. (2008) 方法:2DE 和ESI-Q-TOF MS/MS 2型糖尿病早期肾脏改变:尿液生物标记物 正常白蛋白尿(n=10)、2型糖尿病肾病 (n=12)、健康对照 (n=12). 11 种差异表达蛋白 3 种蛋白减少:前列腺酸性磷酸酶前体(prostatic acid phosphatase precursor), 核酸核酶, 激肽释放酶 -3 8种蛋白进行性增加 :transthyretin precursor
10、, 免疫球蛋白 (Ig) C链 region, Ig V链-II region Cum, Ig- V链-III region SIE, 碳酸酐酶 1,血浆视黄醇结合蛋白 , 2-微球蛋白前体, 2-糖蛋白 1.,Proteomics Clin. Appl., 2(4):478-491.,糖尿病肾病,Lapolla et al. (2009) 方法:MALDI-MS 病例:糖尿病、肾病、糖尿病肾病、健康对照 差异蛋白:1219, 1912, 和2049 Da MALDI-TOF/TOF: uromodulin, I型胶原1 前体, 和 IV型胶原-5 链前体,J. Mass Spectrom.,
11、44(3):419-425.,糖尿病肾病,Wu J, Chen YD, Gu W(2008) 方法:SELDI-TOF-MS 病例:106例正常、微量、大量白蛋白尿DM、 50例健康对照 差异蛋白:4239.0, 4453.5, 5281.1, 5898.5 Da 特异性:80%;敏感性: 75%.,Wu et al. / J Zhejiang Univ-Sci B (Biomed & Biotechnol) 2010 11(4):227-237,糖尿病肾病,Jiang et al. (2009a) 方法:2DE和MALDI-TOF/MS 病例: 2型糖尿病正常白蛋白尿、微量白蛋白尿、大量白蛋
12、白尿和健康对照 差异蛋白:12种蛋白 E-cadherin 增加 1.3-, 5.2-, 8.5倍 Western blot :尿标本中表达增加 ELISA:sE-cadherin/肌酐比显著增高 (DN) 免疫组化:肾小管上皮细胞E-cadherin表达减少 (DN) E-cadherin可作为糖尿病肾病相关的新的标志物,Diabetes Metab Res Rev 2009; 25: 232241.,糖尿病肾病,Jiang et al., 2009b 方法:2DE和MALDI-TOF-MS 目的:监测糖尿病肾病的发生发展 病例:12例DN (1型和2型糖尿病)、 6 健康对照 差异蛋白:o
13、rosomucoid 验证:90例糖尿病患者、30例健康对照 尿orosomucoid排泄率(UOER)随白蛋白尿进行性上升 尿orosomucoid可作为DN的生物标志物,NEPHROLOGY 2009; 14, 332337,2-D gel electrophoresis (2-DE) images of urine samples from diabetic nephropathy (DN) patients and healthy controls.,NEPHROLOGY 2009; 14, 332337,IgA肾病,Haubitz et al. (2005) 方法:CE-MS 差异:
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