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1、第三章 核酸分析与合成 第一节 核酸序列分析,1975年,Sanger加减法 Maxam-Gilbert化学法 1978年, Sanger末端终止法, 1958 胰岛素顺序+1980 测序 一、加减法 1、原理 *0-系统:不等长度片段 *加法:T4 DNA Polymerase+1dNTP(35外切 5 3聚合) *减法:DNA PolymeraseI +3dNTP 2、应用举例 0-系统的产生 加法系统与减法系统,0系统的产生,0系统 +A +G +C +T ATGCTG ATGCTG ATGCTG ATGCTG ATGCTG -TACGAC -TACGAC -TACGAC -TACGAC
2、 -TACGAC -TACGA -TACGA -TACGA -TACGA -TACGA -TACG -TACG -TACG -TACG -TACG -TAC -TAC -TAC -TAC -TAC -TA -TA -TA -TA -TA -T -T -T -T -T 2种片段 1种片段 2种片段 1种片段 下划线为切去的碱基,加法系统,0系统 -A -G -C -T ATGCTG ATGCTG ATGCTG ATGCTG ATGCTG -TACGAC -TACGAC -TACGAC -TACGAC -TACGAC -TACGA -TACGAC -TACGAC -TACGA -TACGAC -T
3、ACG -TACG -TACGAC -TACGA -TACGAC -TAC -TACG -TAC -TACGA -TACGAC -TA -TACG -TAC -TA -TACGAC -T -T -TAC -TA -TACGAC 3种片段 2种片段 3种片段 1种片段 下划线为加上的碱基,减法系统,5标记后电泳、放射自显影: 读序与模板的关系、加减系统存在的必要、0系统存在的必要,二、特异化学试剂裂解法,1、原理:化学修饰碱基-糖苷键和磷酸酯键不稳定而水解 2、特异化学试剂裂解 嘌呤-硫酸二甲酯 嘧啶-肼和呱啶 *裂解G和A的反应(GA) *强化A的裂解(AG) *裂解C和T的反应 *裂解C的反
4、应 举例,5*pGTAC GA AG C+T C 5*pG 5*pG 5*pGT ll 5*pGTA 5*pGTA 5*pGTAC 5*pGTAC GA AG C+T C C A T G 5,C 3,三、末端终止法,DNA聚合酶I及 2, 3-双脱氧核苷酸(ddNTP) 1、原理(genetic-rec-seq) 2、单链的产生:M13 3、停止与压缩反应 停止-M13的二级结构,阻止延伸-提高温度 压缩-由于产物的二级结构,多条条带走到一起-改变变性胶条件 4、测序自动化,3 GTAGCAACT 5 d(ACG)TP+dTTP+ddTTP d(ACT)TP+dGTP+ddGTP d(AGT)
5、TP+dCTP+ddCTP d (GCT)TP+dATP+ddATP T组 G组 C组 A组 3 GTAGCAACT 3 GTAGCAACT 3 GTAGCAACT 3 GTAGCAACT 5 CAddT* 5 CATCddG* 5 CATddC* 5 CddA* CATCGddT* CATCGTTddG* ddC* CATCGTTGddA* CATCGTddT*,A G T T G C T A C,电泳方向,DNA测序中作链终止剂的核苷类似物,2, 3-双脱氧核糖核苷5-三磷酸,复习提纲,1、加减法DNA测序的原理及其实例。 2、特异化学试剂裂解法进行DNA测序的原理和实例。 3、末端终止法
6、进行DNA测序的原理和实例。 4、什么是停止与压缩反应?,第二节 基因的化学合成及诱变,1955 Todd 二核苷一磷酸 磷酸二酯-磷酸三酯-亚磷酸三酯 液相-固相-自动化 1981 有活性tRNAAla-上海生化所-世界上第一个具有全部生物活性的人工核酸分子 一、化学合成法 1、保护基及其去除,核糖-OH、P、碱基的NH2 对保护基的要求:无付反应、稳定、易脱、脱保时链完整 2、缩合剂 磷酸酯键的形成(脱水反应、有机溶剂进行) 双环己基碳二亚胺 DCC 三甲基苯磺酰氯 MS 3、合成方法 (1)磷酸二酯法 付产物多、产率低、操作复杂,(2)磷酸三酯法:核苷间的磷酸基以三酯存在 付产物少、磷酸
7、基被保护可用硅胶柱分离、产率高、反应时间短速度快 (3)亚磷酸三酯法 反应速度快、可固相合成 原理:*末端核苷(3的第一个碱基)固定在高分子化合物上(聚苯乙烯纤维、硅胶、微孔玻璃珠) *循环反应 *洗涤除去未反应物和付产物、简化分纯、加快速度,4、合成寡核苷酸纯化方法 *脱盐:(乙醇沉淀、分子筛、反相柱C18)纯度低 *OPC柱纯化:(DMT)有短链、不适合基因合成和DNA序列分析、不宜纯化多于40mer的oligo *HPLC纯化:吸附于反相柱的差异、用于PCR反应;基因合成和DNA序列分析(较纯,40mer、Grich不适用、设备要求高) *PAGE纯化:可用于任何反应(最纯、无限制、但费
8、事、有毒) 二、寡核苷酸化学合成的实际用途 (1)基因合成的元件 (2)核苷酸序列分析的引物 (3)核酸分子杂交的探针 (4)突变研究,三、基因突变 1、寡核苷酸诱发基因定点突变 (1)原理 突变的寡核苷酸为引物合成DNA-复制-突变 (2)寡核苷酸诱发定点突变过程 M13 正链DNA与突变引物结合-延伸制备异源双链DNA分子-异源双链DNA分子的富集(S1核酸酶、碱性蔗糖密度梯度离心)-转化-筛选(序列分析、限制酶切、杂交、生物学) 突变位点保护:错配碱基外有一个以上碱基,2、缺失突变 (1)特定位点 *酶切(只产生一个酶切位点) *缺失突变探针 (2)随机位点 *DNaseI-在双链产生单
9、链缺口-缺口扩大-S1平端化-重新环化=一组缺失突变体 3、插入突变 (1)位点特异性插入(利用限制酶位点) (2)随机插入(利用化学合成的接头),/-AAGCTT-GAATTC-/ EcoRI /-AAGCTT-G AATTC-/ Pol /-TTCGAA-CTTAAG-/ /-TTCGAA-CTTAA G-/ /-AAGCTT-GAATTAATTC-/ /-TTCGAA-CTTAATTAAG-/,4、盒式突变(cassette mutagenesis) 原理:通过一次寡核苷酸的合成,在一段DNA区域内(20-80nt)产生众多的突变 在预定位点,除正常核苷酸外,以10%添加另三种核苷酸一组兼并寡核苷酸,ATA GTC CCA AAT,复习提纲,5、化学法合成核酸时,哪些基团需要保护?对保护基的要求是什么? 6、核酸的化学合成都有哪些方法?现在常用的是哪种?其原理和过程是什么? 7、合成寡核苷酸纯化方法有哪些?各有怎样的应用范围和局限? 8、寡核苷酸化学合成的实际用途? 9、寡核苷酸诱发基因定点突变的原理和过程。 10、如何诱发缺失突变?如何诱发插入突变? 11、什么是盒式突变?其原理是什么?,
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