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1、2011-5-7,WB实验技术及常见问题分析,Western blot 定义,Western Blot中文一般称为蛋白质印迹 通过聚丙烯酰胺电泳根据分子量大小分离蛋白后转移到杂交膜上 分离的蛋白可以通过一抗/二抗复合物进行检测 是蛋白质分析的最流行的技术之一,Western Blot操作流程,蛋白样品的制备 (蛋白抽提、定量) SDS-聚丙烯酰胺 凝胶电泳 (SDS-PAGE凝胶制备、上样),转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色,水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统的水溶液 对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 细胞裂解液: 50 mmol
2、/L Tris-HCl, 150 mmol/L Nacl ,5 mmol/L EDTA, 1%NP40 , 0.05% PMSF , 2g/mL Aprotinin, 0.5g/mL Leupeptin , pH8.0 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取,包括乙醇、丙酮和丁醇等。,一、蛋白样品的制备,二、蛋白样品的定量(Bradford法 ),原理考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式,在一定浓度的乙醇和酸性条件下,可配成淡红色的溶液,与蛋白结合后形成蓝色化合物,该化合物在595nm处有最大吸收值,化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。 制作标准曲线 (
3、插入表格) 检测样品蛋白含量:取一管考马斯亮蓝+95 l 0.15mol/L NaCl NaCl溶液+5l待测蛋白样品,混匀后静置2min,倒入比色杯中测试。,20-30 ug 细胞/组织裂解物 100 ng 纯化蛋白 根据蛋白表达丰度调整适当的蛋白上样量 上样量一致:每孔上样量保持一致 上样前用loading buffer加热变性样本,三、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,Anode - 内槽缓冲液带有负电荷,与凝胶顶部接触,外槽中缓冲液带有正电荷,与凝胶底部接触,Cathode + 带有负电荷的蛋白质从上到下运动(负极到正极),分开,电泳进程可以根据前沿指示剂来确定,等其跑到底部上面1cm左右即
4、可停止电泳,小分子量蛋白跑的比较快. 蛋白根据分子量大小分开,蛋白质带有负电荷,因此电泳时可以从负极向正极移动,标本加入到上样孔中,四、Western Blot 转膜,分离的蛋白通过电转膜方式从凝胶中转移到杂交膜上(PVDF或NC膜),PVDF膜:价格较贵,可重复使用,特别适合蛋白印迹,结合能力较强,但价格比较昂贵。 NC膜(硝酸纤维素膜):价格比较便宜,应用较广,结合牢固性差一些,韧性也不如PVDF,不能重复使用,但蛋白吸附容量高,亲水性较好。,五、封闭,脱脂奶粉(含5脱脂奶粉的TBST缓冲液 ) BSA Western Blot 膜封闭液(生物试剂公司提供),六、一抗、二抗孵育,把NC膜放
5、在密闭塑料袋或者培养皿中,加入一抗溶液与滤膜温育,室温小时或4过夜。 倒掉一抗溶液,用PBS漂洗滤膜3次,每次10min。 加入配制的二抗,摇床上缓慢摇动, 室温一小时或4过夜。 倒掉二抗溶液,用PBS漂洗滤膜3次,每次10min。,七、二抗与底物反应显色,ECL化学发光显色 比较常用,结果容易控制,但是被催化是 灵敏度差一点 DAB显色 比较灵敏,是HRP最敏感的底物,Western Blot 需要的主要试剂,WB需要试剂膜,常用的有PVDF膜,硝酸纤维素膜或者尼龙膜,WB需要试剂封闭试剂,BSA或者脱脂奶粉(光明脱脂奶粉) 商业化的封闭试剂,主要目的是确定靶蛋白的分子量大小;使用预染的Ma
6、rker还可以实时检测电泳分离情况,并可以转移到膜上。,WB需要试剂蛋白质Marker,Prestained protein ladders,Unstained protein ladders,Fermentas,WB需要试剂一抗,选择适合检测标本种属的一抗(说明书有验证) 选择适用于WB实验方法的一抗(说明书有验证) 选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体 根据说明书推荐的浓度优化最佳稀释比例,Santa cruz, Cell signaling, Invitrogen, Sigma, Abcam, R&D, Abnova, Chemicon, Calbiochem, Millipore
7、, BD, Cayman, Roche, eBioscience, et al.,选择合适的一抗:,杂交需要试剂二抗,二抗选择:根据一抗来源种属以及抗体Ig亚型选择合适的二抗。 二抗的使用: 根据说明书推荐浓度使用TBST稀释二抗。 如果说明书没有推荐浓度,可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度(1:1000-1:20000)。 孵育条件一般为室温1-2小时。,Santa cruz, Cell signaling, Invitrogen, Sigma, Abcam, R&D, Abnova, Chemicon, Calbiochem, Millipore, BD, Cayman, Roche,
8、eBioscience, et al.,杂交需要试剂底物,显色底物:操作简单,灵敏度低,如TMB、DAB、BCIP/NBT 化学发光底物:灵敏度高,需要曝光检测设备(暗室、曝光设备和胶片)或者凝胶成像设备。,WB常见问题,没有信号 高背景 非特异性条带 条带大小不对,标本问题 标本中不含检测蛋白:设置阳性对照 上样量不够,或者蛋白表达丰度比较低:增加上样量 转膜问题 转膜不完全:转膜后使用丽春红染色,确定目的大小蛋白条带是否存在于膜上,使用蛋白质Marker. 洗涤过度:减少洗涤时间和次数. 封闭 封闭过度:减少封闭试剂浓度,封闭时间,更换封闭试剂 抗体孵育和检测 抗体浓度和时间孵育不够:增加
9、抗体浓度,延长孵育时间 一抗不工作:设置阳性对照 二抗不工作:和其他一抗配合检测二抗是否工作 一抗/二抗不匹配:检查抗体的来源和亚型。正确选择二抗 底物失活:重新配制有效的底物,没有信号/弱信号,背景高,封闭 封闭时间不够:延长封闭时间 优化封闭试剂的类型和浓度 封闭试剂和抗体有交叉反应:更换封闭试剂. 磷酸化抗体不能使用含有酪蛋白的封闭试剂:推荐BSA封闭 抗体孵育和检测 一抗/二抗浓度太高:降低抗体浓度 孵育温度太高:建议4度孵育过夜 其他 洗膜不充分:5*3mins,多次短时间的洗膜 曝光时间过长:缩短曝光时间 出现干膜现象:保证膜充分浸透,避免出现干膜 二抗非特异性:设置只加二抗对照,非特异性条带,标本制备 二聚体或者多聚体:增加上样前煮沸变性时间 蛋白不同剪切体或者 isoforms 存在. 蛋白降解:使用新鲜制备的标本,标本中加入新鲜配制的蛋白酶抑制剂 上样量过大:减少上样量 封闭Blocking 封闭不充分:优化封闭时间和封闭试剂浓度 抗体孵育和检测 一抗/二抗浓度过高:降低抗体浓度 抗体没有经过纯化 二抗非特异性结合:使用二抗对照 其他 洗膜保证充分,条带大小不对,标本制备 二聚体/多聚体存在:使用还原变性电泳,除非说明书上有特殊说明 多个亚型存在?(Isoforms) 蛋白降解? 蛋白修饰,The end,
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