第6节载体系统.ppt
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1、第六节 载体系统,1 质粒载体 2 噬菌体载体 3 cosmid克隆载体 4 噬菌粒载体 5 酵母人工染色体载体 6 细菌人工染色体载体,1 质粒载体,1.1 质粒的一般生物学特性 1.2 基因工程中的质粒载体 1.3 pBR322质粒载体 1.4 pUC质粒载体 1.5 穿梭质粒载体 1.6 质粒载体的稳定性问题,1.1 质粒的一般生物学特性,1.1.1 质粒的概念 质粒(plasmid)是独立于染色体外、具有自主复制能力的遗传单位,其本质是较小的核酸分子,大小范围在1kb-200kb以上不等。,1.1.2 细菌质粒的一般生物学特性 (1) 很多细菌中已发现; (2) 是独立于细菌染色体之外
2、的辅助性遗传单位,基因组绝大部分为双链环状DNA,不同质粒大小各异; (3) 大多数质粒的宿主范围较窄;,(4)已发展进化出多种机制以维持其在细菌宿主中的稳定的拷贝数;在不同的宿主细胞中拷贝数可能不同。 (5)复制转录的进行依赖于宿主编码的酶和蛋白质; (6)常含有一些编码对细菌宿主有利的酶的基因。,共价闭合环形DNA (scDNA型),开环DNA (ocDNA),线性DNA (cccDNA),环形双链的质粒DNA分子具有三种不同构型,1.1.3 质粒的命名,用小写字母p代表质粒(plasmid),在p字母后用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称,再加上质粒编号。 如:pBR322:
3、p表示一种质粒,而“BR”则是分别取自该质粒的两位主要构建者F. Bolivar和R. L. Rodriguez,322为编号。,1.1.4 质粒给宿主细胞的标记,(1) 氨苄青霉素 (Ampicillin ) (2) 卡那霉素 (Kanamycin) (3) 四环素(Tetracycline) (4) 氯霉素(Chloramphenicol) (5) 链霉素(Streptomycin) (6)潮霉素(Hygromycin ),1.1.5 质粒的复制类型,据质粒DNA复制与宿主之间的关系分为: (1)“严紧型”复制控制的质粒(stringent plamid):拷贝数少 ; (2)“松弛型”复
4、制控制的质粒(relaxed plasmid):拷贝数多。,1.1.6 质粒DNA的转移,质粒的类型 据能否自我转移可分为: 接合型(conjugative plasmid) 非接合型(non-conjugative plasmid) (2) F质粒(fertility factor) F+ 又叫雄性决定因子,所以F+细胞又叫雄性细胞,相应的 F 又叫雌性细胞。 F质粒(约94kb)在寄主细胞中有三种不同存在方式: F+ F Hfr。,1.1.7 质粒的转化,转化(transformation): 是将异源DNA分子引入另一细胞品系, 使受体细胞获得新遗传性状的一种手段。 质粒转化细菌常用方法
5、:热激法、电击法,1.2 基因工程中的质粒载体,1.2.1 两个概念 克隆载体(cloning vector) : 使目的片段能在细菌细胞中复制的载体; 表达载体(Expression Vector ): 使目的基因能在细菌细胞中表达为RNA或蛋白质的载体。,1.2.2 克隆载体必备条件,(1)具有复制起点 (2)具有抗菌素抗性基因 (3)具有若干限制酶单一识别位点 (4)具有较小的相对分子质量和较高的拷贝数。,1.2.3 表达载体的必备条件,(1)能自主复制 (2)具有方便、灵活的克隆位点和筛择标记 (3)具有能为 RNA聚合酶识别的强大启动子 (4)启动子应可受诱导调控 (5)具有强终止子
6、 (6)具有翻译起始信号,1.2.4 天然质粒用作载体的局限性,局限性:分子量高、拷贝数低、合适的单一酶切位点少、选择标记不合适,1.2.5 质粒载体的选择标记,常用的选择标记: 抗氨苄青霉素、抗四环素、抗氯霉素和抗卡那霉素等基因。 选择标记的应用: 利用质粒编码的可选择标记产物选择目标菌落。,1.3 pBR322质粒载体,pBR322质粒载体的形体图,pBR322质粒载体的结构来源,Tetr,pBR322质粒载体的优点: 具有较小的相对分子质量(4363bp) 具有两种抗菌素抗性基因可供作转化子的选择记号(Ampr和Tetr) 具有较高的拷贝数(15个,松弛型),DNA连接酶,pBR322质
7、粒载体tetr基因插入失活效应,1.4 pUC质粒载体,pUC18,pUC19,含四个部分: (1)来自pBR322的质粒复制起点(ori); (2)ampr ; (3)大肠杆菌半乳糖苷酶基因(lacZ)的启动子及其编码-肽链的DNA序列; (4)多克隆位点(MCS),lacZ,Ori,Ampr,MCS,Blue White,ampr,ampr,Insert,Insert,No insert,Lac Z,Lac Z,具更小的分子质量(2.69kb)和更 高的拷贝数(500 - 700个) 适于组织化学方法检测重组体 具多克隆位点MCS区段,pUC质粒载体的优点,1.5 穿梭质粒载体 (shut
8、tle plasmid vector) 是一类由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号,因而可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。,大肠杆菌-酿酒酵母穿梭质粒载体,其它重要的质粒载体,改造过的质粒载体非常多,能在体外转录克隆基因的质粒载体,1.6 质粒载体的稳定性问题,(1)不稳定性类型 分离不稳定性 结构不稳定性 (2)影响稳定性主要因素 新陈代谢负荷 拷贝数差度,2 噬菌体载体,2.1 噬菌体的结构及其核酸类型 2.2 噬菌体的生命周期 2.3 噬菌体载体 2.4 M13噬菌体载体,2.1 噬菌体的结构及其核酸类型,不同种类的噬菌体颗粒,在结构上有很大差别。 三种不同基本类型:
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