第七章生物大分子的色谱分离和纯化120319.ppt
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1、复 习,浓差极化 浓差极化是指在超滤过程中,由于水透过膜,因 而在膜表面的溶质浓度增高,形成梯度,在浓度 梯度的作用下,溶质与水以相反方向扩散,在达 到平衡状态时,膜表面形成一溶质浓度分布边界 层,它对水的透过起着阻碍作用.,复 习,膜的污染 膜分离过程中随着操作时间的增加,膜透过流 速的迅速下降,溶质的截留率也明显下降,这 被称为膜的污染。污染是由膜的劣化和水生物 (附生)污垢所引起的。,复 习,防止膜污染的方法 (1)预处理法 调整供给液的pH值或添加阻氧化剂来防止化学 劣化;预先清除供给液中的微生物,以防止生 物性劣质等。 (2)开发抗污染的膜 (3)加大供给液的流速,第七章 生物大分子
2、的色谱分离与纯化,第一节 色谱概论 一、色谱的概念 色谱(层析)是一个建立在吸附、分配、离子交换、亲和力和分子大小等基础上的分离过程。又称色层分离。 二、色谱的特点 能够把各个有关的组成成分从复杂的混合物中分离并检测出来。 它是利用不同组分在相对运动、相互不相溶的两相中(其中静止的一相为固定相,相对运动的一相为流动相),吸附能力、分配系数、离子交换能力、亲和力和分子大小等性质的微小差别。经过连续多次在两相中的质量交换,从而使不同组分得以分离,这就是色谱法所依据的基本原理。,必要条件,充分条件,2. 色谱具有高效、快速和灵敏的特点,色谱分离图示,根据混合物中,溶质在互不相溶的两相之间分配行为的差
3、别,引起溶质移动速度的不同而进行分离的方法。 互不相溶的两相分别称为:固定相和流动相。,色谱分离图示,三 、层析的分类,根据溶质分子与固定相相互作用的机理不同的分类,凝胶过滤法,分配层析法,离子交换色层分离法,吸附层析法,疏水作用色层分离法,金属螯合色层分离法,共价作用色层分离法, 根据实验技术的分类,低压层析技术,中压层析技术,高压层析技术,电泳法,操作压力在0.5MPa-5MPa之间,操作压力在5Mpa-40MPa之间,操作压力小于0.5MPa,靠溶质分子在电场中的移动速度 不同而分离, 根据固定相的形状不同的分类:,柱层析法,纸层析法,薄层层析法, 根据流动相的物态不同的分类,汽相层析法
4、,液相层析法, 操作方式不同的分类,迎头法,顶替法,洗脱分析法,层析分类,吸附色谱与其它色谱法的异同点,三、色谱的分类,1.5 层析剂种类,氧化铝 硅胶 活性炭 琼脂糖 纤维素,现代色谱技术中除了分配色谱、吸附色谱外,生物制药中广泛使用的还有离子交换色谱、凝胶色谱和亲和色谱等。选择的原则: 易溶于有机溶剂而难溶于水的样品,选择吸附色谱; 水溶液中可解离成离子的水溶性样品,可选用离子交换色谱; 样品既溶于水,又溶于有机溶剂,可选用分配色谱。 除了平板、纸和薄层色谱外,其余色谱都可以在柱子中进行,因此柱色谱的应用非常广泛。,为何选择色谱作为生物分子纯化方法?,不产生热 不产生外力 高回收率 高分辨
5、率 线性放大,可预期 可自动化 大量成功例子,Principles of Operation for Chromatography Techniques,Gel Filtration,Ion Exchange,Hydrophobic Interaction,Affinity,Reversed Phase,1.色谱分离种类,第七章 生物大分子的 色谱分离与纯化,2.分离对象:酶、多糖蛋白质核酸等. 3.分离类型:分析色谱 (10 mg) 中等规模制备色谱(10-50mg) 制备色谱 (0.1-1g) 工业生产规模色谱 (20g/d),Chromatography,国产气相色谱仪,HP高压液相色谱
6、仪,美国气相色谱仪,4.分离设备,4.分离设备,4.分离设备,制备色谱技术,生产规模制备 色谱柱直径100-800mm,中试规模制备 色谱柱直径50-150mm,小量制备, 色谱柱直径10-40mm,4.分离设备,制备液相色谱系列,半制备液相色谱,中试规模制备色谱,工业规模制备色谱,制备液相色谱,分析液相色谱,5.色谱法的分类 按物理状态分类 根据流动相的物态:气相色谱法(GC)和液相色谱法(LC) 根据固定相的物态:气-固色谱法、气-液色谱法、液-固色谱法、液-液色谱法 按使用的形式分类 (1)柱色谱、(2)纸色谱、 (3)薄层色谱,按分离机理分类 (1)吸附色谱、 (2)分配色谱、 (3)
7、离子交换色谱、 (4)凝胶色谱,6.色谱法的特点 (1)高选择性 (2)高效能 (3)高灵敏度可以分析质量分数为10-610-9数量级、检出限量低至10-1l g的物质,适于微量和痕量分析。,7.色谱法的应用 (1)色谱分析广泛应用于极为复杂的混合物成分分析; (2)液相色谱法,在糖类、氨基酸、农药、染料、贵金属、有机金属化合物等方面得到了广泛的应用。,(3)色谱分离是一种非常有效的提纯物质的技术, 常用于制备分离,得到高纯样品。 (4)色谱质谱联用仪已成为研究生物大分子结构 的重要手段。,第一节 基本理论,一计量置换保留理论 分析色谱与制备色谱: 分析色谱 灵敏度 进样量 毛细管柱色谱 制备
8、色谱 分离与纯化较多的 产品 增加进样量,(2) 溶质计量置换吸附理论: 当一个溶质被吸附剂吸附时,在溶质分子和吸附剂接触表面处必然会释放出一定数目的溶剂分子。 用计量置换这一概念和相同的热力学平衡,将多年来物理化学家和色谱学家各自独立进行研究的液-固吸附机理及溶质在液相色谱中的保留机理统一起来。,第一节 基本理论,二有效柱长和最短柱长 在实际应用中,一般认为色谱柱的长径比为10,是色谱柱较为合适的几何比例。对于生物大分子而言,它的保留主要是由流动相中置换剂的浓度决定的,柱长对生物大分子的分离几乎没有影响,有时会出现短柱较长柱的分离效果还好的情况。,二有效柱长和最短柱长,不同溶质在其迁移速度大
9、于零,但小于流动相的线速度时,溶质在色谱柱上的迁移对分离有贡献,此时溶质迁移所经历的柱长也对分离有贡献;而当不同溶质在其迁移速度等于流动相的线速度时,溶质迁移所经历的柱长对分离无贡献。,二有效柱长和最短柱长 有效柱长(Leff):溶质从开始迁移至其迁移速度等于流动相速度时,溶质在色谱柱上迁移的距离。又叫有效迁移距离。 最短柱长(Lmin):混合溶质中使一对最难分离的溶质1和溶质2的分离度Rs=1时所需的最短距离。,分离度,第二节 装置和操作技术,装置包括:流动相供给、进样、色谱柱和 检测器4大部分。,1.柱色谱系统的组成,色谱介质有各种各样,但柱式色谱系统的组成基本相似,一般由蠕动泵、色谱柱、
10、检测器、记录仪以及部分收集器等几个部分构成。,柱式层析系统的组成基本相似。由以下几个部分构成: A 蠕动泵 B 层析柱 C 装柱 D 加试样 E 洗脱 F 检测器 G 部分收集器,柱层析系统的组成,柱层析装置图,2 纸层析法,2.1 基本原理 2.2 操作方法 2.3 操作步骤,小实验,当滤纸接触到溶剂时,溶液将上升。 滤纸上的小圆点是4种不同的氨基酸的混合物。 看看接下来会发生什么事情,可以看出1号氨基酸上升的最高,在滤纸上跑得最快。 而4号氨基酸与滤纸的结合最紧,因此跑的速度比其他的氨基酸慢。,1,2,3,4,这就是纸层析法。 对照上图,可知道1-4号的各代表什么氨基酸。 纸层析法是分离鉴
11、定蛋白质的氨基酸组成的重要工具。,1,2,3,4,甘氨酸,半胱氨酸,组氨酸,缬氨酸,纸层析小实验动画演示,凝胶装置图,色谱峰和分离结果,第二节 装置和操作技术,柱层析法的一般技术,1层析柱 层析柱通常是玻璃的。总的说来,长柱分辨好。但大量物质的处理则用粗的柱比较适宜。层析柱的基本装置如图。,2层析材料的准备 许多材料都可在层析法中使用。在装柱前这些材料要用溶剂平衡,另外还需作一些预处理。例如,凝胶层析材料需要溶胀,吸附剂需要加热或酸处理来活化,离子交换树脂需要用酸碱处理来得到所需的电离形式。,在用溶剂平衡时,先使材料沉淀,用倾泻法除去悬浮的细颗粒,否则由于细颗粒的堵塞,溶剂的流速将显著降低。,
12、3装柱 层析柱的填装是先关闭出口,用溶剂灌注至13体积,并使支持板下的“死体积”不存有气泡,再慢慢地向溶剂中加浆状物,要小心地沿着玻棒倾注以防止气泡存留在柱内。让悬浮液沉淀,并放出过多的溶剂,为了避免分层。最好一次装完,如需分几次填装,则在二次填装前应先在已经沉淀的表面用玻棒搅拌后再倾注,重复这个过程,直至装到需要的高度。用溶剂彻底洗涤层析柱后使液面降到比层析床表面略高一点。最后覆盖一张圆形滤纸或尼龙布,以免加样时扰乱床表面。,4加样 上柱前,先将样品溶解在溶剂里或对洗脱液透析,样品溶液的浓度应该尽可能高些,以减少样品溶液体积,使区带狭窄。将样品仔细加到层析床的表面,打开旋塞至液面与床面齐,然
13、后连接溶剂池,保持一定高度的液面。,4)上样 样品浓度越高越好;上样体积越小,分辨率越高; 上样体积一般为床体积的15%; 例外:G-25脱盐30% 亲和层析为床体积的几倍,5洗脱 用适当的洗脱液把各组分依次从柱上洗脱下来。 3)洗脱 影响分离效果的主要因素之一: 洗脱流速。 要求流速合适而恒定。,洗脱方式 连续洗脱(continual elution):同一种洗脱液洗脱 分步洗脱(stepwise elution):用两种或两种以上不同洗脱液分段洗脱 梯度洗脱(gradient elution):梯度改变洗脱液的pH值、离子强度或极性 梯度洗脱液的制备装置:梯度混合器、梯度三通阀或简易梯度形
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