第二十章比色法和分光光度法chapter20479101053.ppt
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1、第二十章 比色法和分光光度法,20.1 概述 20.2 光吸收定律 20.3 比色法和分光光度法及其仪器 20.4 显色反应与显色条件的选择 20.5 分光光度法仪器测量误差及消除 20.6 分光光度法的应用 20.7 荧光分光光度法,20.1 概述,20.1.1 分(吸)光光度法及其特点 比色法:利用有色溶液颜色的深度测定该溶液的浓度。 目视比色法:用肉眼直接比较样品和标准溶液的颜色深浅。 分光光度法:用光电比色计或分光光度计测量溶液吸光度。 分光光度法的特点: 灵敏度高。10-3 10-6 mol/L。 准确度高。相对误差25。 仪器设备简单、操作简便。 应用范围广。,20.1.2 吸收光
2、谱 光谱区的划分,微波 远红外 近红外 可见光 近紫外 真空紫外 X-射线 -射线,波长,1000um,10um,100nm,10nm,红 620 750nm 橙 590 620nm 黄 570 590nm 绿 550 570nm 青 495 550nm 蓝 450 495nm 紫 380 450nm,190400nm,2. 可见光吸收光谱,光的互补色示意图,白光,红,橙,黄,绿,青,青蓝,蓝,紫,单色光:单一波长光 复合光:复合波长光 互补光:处于同一直线上的两种光。 互补光按一定强度比例混合,即得白光。 溶液颜色:互补光的颜色。,吸光度:某波长的光通过含有紫外-可见光吸收的物质溶液后,被吸
3、收的光的比例。,吸收光谱曲线:溶液对不同波长光的吸收强度,即以入射光波长为横坐标,吸光度为纵坐标所做的一条曲线。,最大吸收波长:物质对该波长的光吸收最大,即吸收光谱曲线上的最大峰值。,3. 吸收光谱曲线,透过率:某波长的光通过含有紫外-可见光吸收的物质溶液后,没有被吸收的光(即透过的光)的比例。,四种川芎内酯化合物的紫外吸收光谱图 1-洋川芎内酯H;2-洋川芎内酯I;3-瑟丹酸内酯;4-藁本内酯,物质分子的运动状态 分子轨道中价电子的高速旋转;原子在平衡位置的振动; 分子自身的转动。 分子的能量 价电子能级的能量振动能级的能量转动能级的能量 能级差与对应的光谱 价电子能级间能量差1-20eV,
4、紫外-可见光的能量; 振动能级间能量差0.05-1eV,红外光的能量; 转动能级间能量差10-4-0.05eV,远红外光及微波的能量。,4. 物质吸收光的本质,吸收光谱与发射光谱 分子吸收能量后受到激发,分子就从基态能级跃迁到激发态能级,因而产生吸收光谱。 处于激发态的分子返回基态或能级较低的激发态,就会以光子的形式释放能量,从而产生发射光谱。,紫外-可见吸收光谱 分子中的价电子吸收特定波长的光(紫外-可见光)后,从基态跃迁到激发态。,20.2 光吸收定律,朗伯(Lambert)定律:一束单色光通过吸光物质的溶液后,光吸收程度(吸光度)与溶液液层厚度成正比。,A为吸光度; I0为入射光强 I为
5、透过光强; T为透光度 k为比例常数 b为液层厚度(光程长度),b,I0,I,即:,比耳(Beer)定律: 一束单色光通过吸光物质的溶液后,光的吸收程度与吸光物质微粒(分子)的数目(浓度c)成正比。即:,朗伯-比耳定律:,当b单位为cm,c的单位为mol/L时的吸光系数称摩尔吸光系数,其单位为cm-1mol-1L。 的大小与吸光物质的性质、入射波长和温度有关。,朗伯-比耳定律的适用范围: 不仅适用于溶液,也适用于均匀的气态吸光物质和固态吸光物质; 它是各种吸光光度法定量分析的依据。,思考:摩尔吸光系数如何测定?,工作曲线(标准曲线): 测定信号的大小随被测物浓度变化的曲线。要求这一曲线为直线,
6、即测定信号与被测物浓度成正比。 理想情况下工作曲线过原点; 直线的线性范围是有限的(高浓度端偏离);通常要求两个数量级以上的线性范围; 样品中被测物浓度应在工作曲线的线性范围内。,偏离比耳定律: 即工作曲线在高浓度端发生偏离。,偏离比耳定律的原因: 比尔定律本身的局限性。比尔定律假设了吸光分子之间无相互作用,事实上,高浓度时分子间相互作用不可忽略。 入射光为非单色光时的偏离。仪器的分光元件(单色器)很难得到真正的单色光,而是波长范围很窄的复合光带,而比耳定律仅在入射光为单色光时才是正确的。 化学因素引起的偏离。其一是介质不均匀(胶体、乳浊液、悬浮液)而产生折射、散射和反射,使透过光强减弱(A增
7、大)。其二是吸光分子发生化学变化而改变浓度。,20.3 比色法和分光光度法及其仪器,1. 光度分析方法 目视比色法: 光电比色法:用光电比色计测定未知溶液和标准溶液的吸光度。 光电比色计用滤光片得到较窄波长范围的入射光; 分(吸)光光度法:用分光光度计测定未知溶液和标准溶液的吸光度。 分光光度计用棱镜或光栅做分光元件得到单色入射光。,2. 分光光度计的基本部件,光源,单色器,吸收池,检测系统,结果显示,光源: 在可见和近红外区使用钨灯或碘钨灯,波长范围320-2500nm; 在紫外区使用氢灯或氘灯,波长范围180-375nm。 使用稳压器保证光强稳定。,单色器: 色散元件:将连续光谱分解为单色
8、光的元件(如棱镜、光栅); 单色器:由入射狭缝、准直透镜、色散元件、聚焦透镜和出射狭缝构成。 玻璃吸收紫外光,所以玻璃棱镜仅用于350-3200nm波长范围,只能用于可见分光光度计;石英( 185-4000nm )则可用于整个紫外-可见光区。 光栅利用光的衍射与干涉作用,其优点是适用波长范围宽、色散均匀、分辨率高;但其缺点是各级光谱有重叠而产生相互干扰。,吸收池(比色池、比色皿): 用无色透明、耐腐蚀的光学玻璃或石英制造。 因玻璃吸收紫外光,所以玻璃吸收池只能用于可见光区。 杯差:一对比色池对光吸收的差异,实验前要先校杯差。,检测系统: 光电转换元件(硒光电池、光电二极管)。,结果显示部分:
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