第二十章经典液相色谱法.ppt
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1、现代仪器分析 经典液相色谱法,经典液相色谱法,包括经典柱色谱法和平面色谱法。 经典液相色谱法是在常压下靠重力或毛细作用输送流动相的色谱方法。 经典色谱法与现代色谱法的区别: 主要在于输送流动相方式、固定相种类和规格、分离效能、分析速度和检测灵敏度等方面。,经典色谱法优点:,设备简单,操作方便。 分析速度快。 广泛的应用:在药物研究、食品化学、环境化学、临床化学、法检分析及化学化工等行业都有用。 (特别是在天然药物的分离研究及定性鉴别等方面发挥着独特的作用,是中国药典中药的主要鉴别手段之一。),内容简介,第一节 吸附柱色谱法,一、定义: 固定相为固体吸附剂、流动相为液相 的柱色谱法,分离原理:
2、K值不同而产生差速迁移,应用:样品预处理、化学分离,(一)吸附与吸附平衡,(二) 吸附等温线 (absorption isotherm),吸咐等温线:指在一定温度下,某一组分在固定相和流动相之间达到平衡时,以组分在固定相中的浓度Cs为纵坐标,以组分在流动相中的浓度Cm为横坐标得到的曲线。 它是分配系数K的的图示方法,吸咐等温线有三种类型:线型、凸型和凹型。,(高斯峰),(拖尾峰),(前延峰),三种等温线的讨论,1线形吸附等温线: (高斯峰) 整个工作浓度范围K是常数,谱带移动速度与浓度无关,故色谱峰前沿和后沿都是对称的,呈高斯分布。 2凸形吸附等温线: (拖尾峰) K随浓度变化,浓度 ,K变
3、,溶质移动速度加快,故色谱峰有一个变锐的前沿和扩散的后沿。 3凹形吸附等温线: (前延峰) K随浓度变化,浓度 ,K变 ,故色谱峰有一个扩散的前沿和锐利的后沿。,进样量对保留值的影响,(1)对称峰的保留值与进样量无关 (2) 拖尾峰的保留值随进样量增加而减少 (3)前延峰的保留值与进样量增加而增加 所以,为了保证流出曲线的对称性,防止拖尾,在色谱分析中就应该控制溶质的量,每种色谱方法有一定的线性范围,超出了这一范围,不对称峰就会出现。,二、吸附剂,吸附色谱的固定相为吸附剂,有以下特点(要求): 较大的比表面和一定的吸附能力大于200M2/克 较好的选择性 良好的稳定性(化学惰性),且不溶于洗脱
4、剂 粒度均匀,粒度要细,使用方便(d=75150m,即 100200目) (一)常用的吸附剂 吸附剂可分为有机和无机两大类。 有机类:活性炭、淀粉、蔗糖、乳糖、聚酰胺以及纤维素等; 无机类:氧化铝、硅胺、氧化镁、碳酸钙、磷酸钙、滑石粉、硅藻土等。其中以硅胶和氧化铝、聚酰胺较为常用。,1. 硅 胶,常以SiO2XH2O表示,是多孔性的硅氧交链结构。其骨架表面的硅醇基,能吸附大量水分,硅胶的活性与含水量有关。 硅胶由于硅醇基的存在,能吸附大量水分,这种表面吸附水称为“结合水”,加热至 105110左右能除去。称为,“活化”,硅胶:中等极性吸附剂 吸附机制: 表面的硅醇基,与物质形成氢键,适用范围:
5、具微酸性,适于酸性和中性物质,失活:水与硅醇基结合使其失去活性,活化:105-110加热30min,粒度:100200目,硅醇基的两种形式:,硅醚结构,1.游离型,2.键合型,到200,非极性,不再对极性化合物有选择性保留作用而失去色谱活性,2.氧化铝:强极性吸附剂,吸附机制:碱性位置、Al-OH,粒度:100200目,分类:碱性、中性和酸性,活化温度:200400,2. 氧化铝 :,为一种吸附力较强的吸附剂,具有分离能力强、活性可以控制等优点。,(二)吸附剂的活性,吸附剂的活性和含水量有一定的关系: (1)含水量愈高,其吸附活性愈低,(2)活性级数愈大,吸附力就愈弱。 氧化铝与硅胶相比:副反
6、应多、回收率低,样品处理量大、 分离效果好,25,5,15,10,3,6,0,38,0,15,(活度测定法:Brockmamn法),3.聚酰胺,商品名:锦纶、尼龙-6 白色多孔的非晶型粉末 不溶于水和有机溶剂,易溶于甲酸、酚、浓酸,分离机制:主要是氢键吸附,适用对象:黄酮类,粒度:60100目,三、色谱条件的选择,酰胺类醇类酚类羧酸类,二甲胺酯类酮类醛类硫醇胺类,醚硝基化合物,烷烃烯烃,烷烃烯烃醚硝基化合物二甲胺酯类酮类醛类硫醇胺类酰胺类醇类酚类羧酸类,常见化合物按其极性由小到大顺序为:,常用溶剂的极性顺序为:,吸附剂的极性顺序为:,吸附剂和流动相的选择,1、被测物质的结构、极性与吸附力,吸附
7、规律:通常组分极性强,吸附强,后出柱 组分极性弱,吸附弱,先出柱,多糖、蛋白质等大分子、生物碱盐 苷类(皂苷、黄酮苷、蒽醌苷) 黄酮、蒽醌等苷元、有机酸 香豆素、萜类、挥发油等亲脂性成分,极 性 渐 小,2、吸附剂的选择及用量 酸性成分:硅胶 碱性成分:氧化铝 黄酮类:聚酰胺,化学分离:氧化铝用量为样品量的20-50倍, 硅胶为30-60倍 除杂:一般用量10倍,3、流动相的选择 “相似相溶”原理 常用:不同配比的甲醇-水或甲醇 亲脂性成分用氯仿、乙酸乙酯,吸附剂类型: (1)硅胶: 硅胶H, 硅胶G, 硅胶GF254 (2)氧化铝: 氧化铝G,氧化铝H, 氧化铝HF254 (3)聚酰胺,展开
8、剂选择: 单一、二元、多元展开剂?,选择三原则:综合考虑 1.被分离组分性质, 2.展开剂极性, 3.吸附剂活度,1. 三角形选择法,固定相,流动相,2.可用点滴实验法选择展开剂,先用单一溶剂展开, 若Rf值太小,则加入一定量极性强的溶剂,如乙醇、丙酮等, 如果Rf值太大,则加入适量极性弱的溶剂(如环己烷、石油醚等),以降低极性。 可加入一定比例的酸或碱,使斑点集中。 为了提高分离一般用二元甚至五元展开系统。,四、操作方法 1、色谱柱的制备 要求:填装均匀、紧密,不能有气泡。 装柱时柱要垂直,表面平整。 固定相的用量适宜。 柱体:色谱柱、注射器、滴定管 方法:干装法、湿装法,2、上样,3、洗脱
9、,四、操作方法,根据被分离物质而定,内径与柱长 的比例,一般在11020之间,吸附剂的用量应根据被分离的 样品量而定,色谱柱的制备,(一)柱色谱(玻璃、石英柱、尼龙柱),吸附剂的颗粒大小一般应在 100200目,(1)玻璃柱,干装法,湿装法,1.色谱柱的制备 (原则是填充均匀!),(2)尼龙柱,应有一定的强度,且易于切割; 对有机溶剂呈惰性,能用手工热封; 能透过紫外线,便于将无色物质在柱上定位。 填充时将一端封闭,底部塞入玻璃棉并打上小孔,装匀即可。,柱色谱的制备流程 (四步曲),1.色谱柱的制备,2. 加样 3.洗脱,4检 出,装柱,(1)溶解样品 (2)上样 (3)洗脱,采用相应的物理和
10、化学方法进行检出。 常用的检出方法很多,如化学反应法、 TLC及其它方法,(1)玻璃柱,(2)尼龙柱,2. 加样与洗脱,(二)薄层色谱 (thin layer chromatography),TLC:固定相(吸附剂或载体)涂布成一均匀薄层,点样,(密闭的容器中)展开,斑点显色,(与对照物质)比较进行定性定量。,1.供试品溶液 2.对照品溶液 3.阴性对照溶液,冰片的薄层色谱图,特点:,快,需十至几十分钟,同时展开多个试样。 试样预处理简单,对试样限制少。 载样量比较大,适用于制备。 仪器简单,操作方便。 分离能力较强。 灵敏度较高。,薄层色谱法的应用广泛,微量、快速、简便的分离分析技术; 广泛
11、应用于药用植物的分析中,并作为植物药鉴别方法被世界上多数药典收录。 2005版药典中现代分析技术得到进一步扩大应用。药典一部品种中薄层色谱法用于鉴别的已达l523项,用于含量测定的为45项; 对于大量的有机化合物都能直接检测,包括很难用于气相色谱分析的较高沸点样品;,按分离机理:吸附、分配、离子交换等。 吸附薄层色谱法 原理:组分在薄层板上吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的过程。 组分因吸附系数不等实现分离。 (吸附薄层应用最为广泛,重点讨论!),薄层色谱法的主要类型和原理,薄层色谱法的主要类型和原理,分配薄层色谱法 原理:多次分配的过程,分配系数(溶解度)不等实现分离 分类:正相色谱、反相色谱
12、 正相色谱:水为固定相(硅胶载体),有机溶剂为流动相。 极性强的组分K大, Rf值小。 反相色谱:烷基化学键合相为固定相,水有机溶剂为流动相。 极性强的组分K小, Rf值大。,薄层色谱操作方法(四步曲),1. 制板 均匀 2. 点样 集中 3. 展开 (多种方式) 预饱和与否? 4. 斑点检出 显色,1. 制 板,(1)手工制板 不含粘合剂的软板及含粘合剂的硬板 板材:玻璃板 规格:10cm10cm,10cm15cm,20cm10cm或20cm20cm的2mm厚 制板厚度:0.3、0.4、0.5及0.6mm四种规格,硅胶的活度:与含水量的关系:含水量高,活性 级高,活度低。 活化:加热至100
13、左右,除去吸附水提高活度。30min左右 (注意温度不可过高) 分离效率:与其粒度、孔径及表面积等有关。 常用硅胶: 硅胶H,不含黏合剂 硅胶G,含煅石膏黏合剂 硅胶GF254,含煅石膏和一种无机荧光剂,即锰激活的硅酸锌,在254nm紫外光下呈强烈黄绿色荧光背景。,仪器装置: (2)预制板 由工厂生产出来的商品板,使用方便,涂布均匀,薄层光滑,牢固结实,分离效果及重现性好。,加入固定相匀浆,2点样成功分离和精确定量的关键,点样要求: 点样体积:110L 点样原点通常应小而圆,点样量大时可以选择细带状点样,距板边缘1.0-1.5cm; 需要可多次点样(每次挥干后),防止边缘效应; 点样量勿超载,
14、防止拖尾;勿伤薄层表面,点样装置: 1.定量毛细管 2.手动点样器 3.薄层自动点样仪,1.定量毛细管,2.手动点样器,3.薄层自动点样仪,3展开 条件选择决定分离结果,展开原理: 差速迁移 展开方式:上行、下行、径向、楔形、双向、多次展开等。 上行展开:展开剂从下往上爬行。 注意事项: 1.密闭的展开系统(展开缸); 2.展开剂浸入薄层下端不超过0.5cm; 3.点样处不能接触展开剂; 4.展距一般距薄层顶端1-2cm。,展开过程:,展开缸内溶剂饱和 再行展开 挥干溶剂,挥干展开剂,再行展开,饱和,边缘效应 : 点于同一薄层的同一物质的斑点,在色谱展开过程中,靠薄层边缘处斑点的Rf值与中心区
15、域斑点的Rf值有所不同,多数呈凹形。,减少边缘效应的办法:,(1)最好用较小体积的展开缸或将薄层在缸内放置一定时间,待溶剂蒸汽达到饱和后再行展开; (2)在展开缸内壁贴上浸湿展开剂的滤纸条; (3)如采用3cm以下的狭小薄层板,只点23个点时,也会减小边缘效应。,4斑点的检出,(1)光学检出法 自然光下直接观察斑点。 可吸收紫外光,发射不同颜色的荧光斑点,在紫外灯下显现不同颜色。紫外分析仪有 (254nm)和 (366nm)两种灯。 在可见紫外光下都不显色,可以用荧光薄层进行分离。 (2)试剂显色法 喷雾显色 浸渍显色 蒸气检出法(用I2,NH3等挥发性物质),五、定性与定量分析,早期的TLC
16、技术,主要用于定性和间接间接定量。 70年代发明TLC-SCAN后,定量工作得到发展,比较著名的有: 1.瑞士卡玛CAMAG公司(昂贵,性能好); 2.日本岛津CS系列(便宜,一般用); 3.上海科贺生化技术有限公司(国内唯一),定性分析 比较Rf值、斑点颜色或荧光 常采用已知标准物质对照(同一板上展开) 多种展开系统的Rf值与对照品一致。 定量分析 洗脱法(间接定量法) 直接定量法 1.目视比较法(如杂质限度检查方法) 2.薄层扫描法,薄层色谱法参数,定性参数 1)比移值(Rf值) 2)相对比移值(relative Rf;Rr) 相平衡参数 1)分配系数K= Cs/Cm 2)容量因子 k=
17、CsVs/CmVm,定性参数 1,比移值(Rf值) 溶质移动距离与流动相移动距离之比。(速度之比?) Rf =L/L0 (定时展开) L为原点(origin)至斑点中心的距离,L0为原点至溶剂前沿的距离 。 与组分及色谱条件(展开剂,展距,薄层板等)有关; 在给定条件下,Rf值为常数,其值在0.20.8之间,定性参数2,相对比移值(relative Rf;Rr) Rr = Rf (i)/Rf (s)=L(i)/L(s) 与组分、色谱条件、参考物质有关。 Rr值可以大于1,也可以小于1。 重现性和可比性均比Rf值好,能消除系统误差(参考物质与组分在完全相同的条件下展开),相平衡参数,分配系数K=
18、 Cs/Cm 容量因子 k= CsVs/CmVm K、k与Rf值的关系:,相平衡参数与Rf值关系,K、k与Rf值关系推导: (与定距展开比较) Rf =L/L0=u/u0=R= R为保留比(见P224公式) 影响Rf值最重要的因素是: 吸附剂的性质与展开剂的极性和溶解能力。 薄层厚度、展开距离、展开剂的饱和度、点样量,薄层色谱法定量分析,洗脱法(间接定量法) 展开后将被测物斑点或区带捕集,用溶剂洗脱,然后再用适当的分析方法(比色法、分光光度法、气相色谱、荧光分析法等)测定含量。 直接定量法 1.目视比较法(如杂质限度检查方法) 2.薄层扫描法(TLC-SCAN),薄层扫描法 (TLC-SCAN
19、),用薄层扫描仪直接测量板上被分离化合物斑点的吸收光、反射光、荧光等进行定量的方法,称为薄层扫描法。 优点: 该法快速、简便,结果灵敏、准确,适用于多组分物质和微量组分的定量。薄层扫描法虽然精密度不如HPLC法高,但可作为补充,用于无紫外吸收,或不易用HPLC法分析的组分如人参皂甙、贝母生物碱等。,TLC-SCAN 试验条件的选择,薄层色谱条件:原则组分应完全分离,斑点对称,均匀, 不拖尾。 检测方法:吸收测定法和荧光测定法两种。在可见、紫外区有吸收的组分,可在200800nm范围内采用吸收测定法测定。有荧光的组分,可选择好激发光波长(ex)和发射波长(em),用荧光法具有专属性强、灵敏度高和
20、线性范围宽度等特点。,(3)吸收测定法原理: 光学系统: 光源(氘灯与钨灯)、单色器(入口狭缝出口狭缝、光栅等)以及检测器(监测光电倍增管、反射和透射测定光电倍增管)组成。 吸收测定类型:有反射法和透射法两种。 反射法:将光束照射到薄层斑点上,测量反射光的强度;反射光灵敏度较低,受薄层厚度影响较小,基线较稳,信噪比较大,因而使用较多。,反射法示意图:,单色器,透射法:受薄层厚度影响较大,且玻璃对紫外光有吸收,所以实际应用较少。,薄层扫描仪光学系统结构示意图,反射法,透射法,基本原理与方法,分为薄层吸收扫描及薄层荧光扫描两类方法。 1. 薄层吸收扫描法的基本原理 用可见光或紫外线的单色光照射展开
21、后的薄层色谱板,测定薄层色谱斑点(简称斑点)的吸光度(A)随展开距离(L)的变化,而获得AL成ARf曲线,即薄层色谱扫描图(简称扫描图)。曲线上的色谱峰面积可用于定量分析。 由于薄层板存在着明显的散射现象,而使斑点中物质的浓度与吸光度的关系不服从Beer定律,需田KubelkaMunk(古柏尔卡曼克)理论来描述。(该方程式是薄层扫描法的定量分析基础)。,式中Sx是薄层板的散射参数,它与固定相的种类、粒度、薄层厚度及涂布均匀程度有关。 式中的X为薄层厚度,,1.1 KubelkaMunk理论,KubelkaMunk理论说明了固定相的散射参数对斑点中物质的浓度与吸光度间关系的影响。该理论的基本方程
22、式如下。 (1)薄层色谱斑点的透射率:,(2)薄层色谱斑点的反射率(R),K为单位薄层厚度的吸光系数。 K虽称为“吸光系数”是因“单位厚度”而得名,它与分光光度法中物质的吸收系数不向,与薄层色谱斑点中物质的浓度有关。KX称为吸收参数,相当于薄层色谱斑点单位面积中物质的含量(ugcm2),KX的含义:,(3)薄层色谱斑点的吸光度(A),理想的空白薄层板(简称空白板)的单位薄层厚度的吸光系数K0。事实上,一般空白板K0。为了消除此影响,通常在薄层扫描中都是以空白板为基准,测定相对透光率及相对反射率来计算薄层色谱斑点的吸光度。 (a)在透射法中薄层色谱斑点的吸光度:,i及i0分别为透过斑点及空白板的
23、透射光光强; I0为照射光光强; T与T0分别为斑点及空白板的透射率;,反射法示意图,(b)在反射法中薄层色谱斑点的吸收度A:,1.2 KubelkaMunk曲线,曲线是以薄层固定相不吸收照射光,即空白板的K0为前提,按照空白板的散射参数,用KubeIkaMunk理论有关方程式算出斑点的AKX理论曲线。由于薄层固定相颗粒的散射作用,对于透射法及反射法造成偏离Beer定律的影响正好相反,故需按两种情况讨论。 (1)透射法的KubelkaMunk曲线,(2)反射法的KubelkaMunk曲线,透射法和反射法的KubelkaMunk曲线比较:,由于薄层固定相的散射作用使在透射法中所测得的斑点的吸光度
24、产生正偏差,而在反射法测定时产生负偏差。这是因为照射光被散射,降低了透射率,吸光度增加;散射光增加了反射光光强,增加了反射率,而降低了吸光度的缘故。 其次,还可发现后图比前图的横座标大50倍,说明了反射法的灵敏度(响应值)比透过法小。,1.3 Kubelka-Munk曲线校直,KubelkaMunk曲线说明了薄层色谱斑点的吸光度与其浓度间呈非线性关系,该曲线是薄层扫描法进行定量分析的理论依据。 曲线处理采用两类方法: (1)曲线校直法(CS系列仪器) (2)采用及计算机回归法(线性及非线性回归)。(CAMAG仪器) 曲线校直法是根据薄层板的散射参数SX值,将KubelkaMunk曲线校正为直线
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- 第二十 经典 色谱
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