第二章-2基因克隆载体-99.ppt
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1、第二章 基因工程的基本条件,一、用于核酸操作的工具酶 二、基因克隆载体 三、目的基因的制备 四、基因工程受体菌或细胞,二、基因克隆载体,(一)载体的功能及特征 (二)质粒 (三)噬菌体或病毒DNA (四)Cos质粒与噬菌粒 (五)人工染色体载体,(一)载体的功能及特征,在基因工程操作中,能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子。,载体(vector):,载体的功能:,为外源基因的扩增或表达提供必要的条件。,运送外源基因高效转入受体细胞;,为外源基因提供复制能力或整合能力;,载体应具备的条件:,具有针对受体细胞的亲缘性或亲和性(可转移性);,具有合适的筛选标记。,具有较高的外源DNA载装能力;,
2、具有多种单一的限制酶酶切位点;,具有与受体细胞相适应的复制位点或整合位点;,基本概念:,2)存在于细菌、真菌、蓝藻、酵母等细胞中。,(二)质粒(plasmid),1)是生物细胞内固有的、能独立于染色体而自主复制、并被稳定遗传的核酸分子。,The genomic DNA of E.coli: a single circular double-stranded DNA, with the contour length about 850 times longer than the cell,plasmid DNA,Genomic DNA,4)绝大多数的天然DNA质粒具有共价、闭合、环状的双链结构(
3、covalently closed circular DNA, cccDNA),以超螺旋形式存在。,3)绝大多数质粒是DNA型的;,酵母的杀伤质粒(killer plasmid)是RNA。,7)最大装载量:15 kb(5%)。,5)分子大小:1-300 kb;,质粒不是单纯的寄生,携带的遗传信息赋予细菌特定的遗传性状,如抗生素抗性基因Ampr。,质粒与宿主细胞的关系:,质粒对宿主的生存不是必需的,只是“友好”的“借居”宿主细胞中。,质粒离开宿主就无法生存,只有依赖宿主细胞的帮助,才能完成自身的复制、转录。,质粒的基本特征:,自主复制性,不相容性,可转移性,携带特殊的遗传标记,1、自主复制性,质
4、粒DNA上的复制子结构决定了质粒与寄主的对应关系。,质粒能利用寄主细胞的DNA复制系统,进行自主复制。,严紧型质粒,根据在每个细胞中的分子数(拷贝数)多寡,质粒可分为:,松弛型质粒,1-3拷贝/cell,复制受细胞核控制,伴随染色体DNA复制而复制。,如:pSC101、p15A。,1)严紧型质粒(stringent plasmid):,加入氯霉素(终浓度10-170g/ml)抑制细菌蛋白质合成后,可达3000拷贝/cell 。,2)松弛型质粒(relaxed plasmid):,如:pMB1、ColE1。,10-200拷贝/cell,复制不受细胞核控制,染色体DNA复制停止时,仍可进行复制。,
5、2、不相容性(incompatibility),指任何两种含相似复制子结构的不同质粒,不能同时存在于一个细胞中。,分子机制:,两种含不同复制子结构的不同质粒,在复制时受各自的拷贝数控制系统调节,致使两种质粒的最终拷贝数恒定,经若干复制周期和细胞分裂周期后,仍能共处于同一细胞内。,两种含相似复制子结构的不同质粒,在复制时受同一拷贝数控制系统的干扰,致使两种质粒的最终拷贝数不同,其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势。,不相容性的质粒组成不相容性群,如:,ColE1、pMB1有相似复制子结构,彼此不相容;,pSC101、F、RP4有相似复制子结构,彼此不相容;,p15A及其衍生质粒有相似
6、复制子结构,彼此不相容。,3、可转移性,接合型质粒(conjunctive plasmid),非接合型质粒(nonconjunctive plasmid),除带有自我复制所必需的遗传信息外,还带有一套控制细菌配对和质粒接合转移的基因。,1)接合型质粒:,能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞,如F质粒。,符合基因工程的安全要求。,2)非接合型质粒:,不能在天然条件下独立地发生接合作用,如ColE1质粒。,虽带有自我复制所必需的遗传信息,但失去了控制细菌配对和质粒接合转移的基因。,值得注意的是,某些非接合型质粒(如ColE1)在接合型质粒的存在和协助下,也能发生DNA转移,这个过程由 b
7、om和mob基因决定。,4、携带特殊的遗传标记,这些标记基因对重组DNA筛选有重要意义。,野生型质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因,使寄主产生正常生长非必需的附加性状。,抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物,抗生素、细菌毒素、有机碱,质粒的空间构型:,共价、闭合、环状DNA(cccDNA) 超螺旋(super coil DNA, scDNA),开环DNA(open circular DNA, ocDNA) 一条链上有一至数个缺口,线形DNA(linear DNA, L-DNA),质粒空间构型与电泳速率:,质粒的分类,1、按功能:,F质粒(fertility factor),R质粒(r
8、esistance factor),Col质粒(coliconogenic factor),1)F质粒:,性质粒,决定细菌性别,能在天然条件下自发地从一个细胞转移到另一个细胞。,R质粒:,Col质粒:,大肠杆菌素质粒,带有控制大肠杆菌素合成的基因,合成大肠杆菌素,杀死不含Col质粒的亲缘细菌。,接合型质粒,2、按转移方式:,非接合型质粒,3、按复制机理:,接合型质粒分子量大,一般属严紧型。,非接合型质粒分子量小,一般属松弛型。,4、按分子量大小:, 15kb,多为接合型质粒;, 15kb,多为非接合型质粒。,质粒的构建,分子量大;,野生型质粒的特性提供了以其为基础、人工构建载体分子的可能。,拷
9、贝数低;,单一酶切位点少;,遗传标记不理想。,如:天然质粒pSC101分子量9.09kb,只有1个EcoR I切点充当克隆位点,筛选标志只有Tetr。,可通过插入失活筛选,但免疫筛选E1的操作非常麻烦。,ColE1的筛选标志是大肠杆菌素E1,唯一的克隆位点EcoR I正好位于这个基因内部。,大于20kb的质粒很难导入受体细胞,且极不稳定。,质粒的改造与构建:,尽量缩小质粒的相对分子量,提高外源DNA的装载量。,1)删除不必要的DNA区域,,灭活对质粒复制产生负调控效应的基因,提高质粒的拷贝数。,2)灭活某些编码基因,灭活促进质粒在细菌种间转移的mob基因,杜绝重组质粒扩散污染环境,保证DNA重
10、组实验的安全性。,最好有两种选择标记基因,并且在选择标记基因区内有合适的克隆位点。,3)加入选择标记基因:,当外源DNA片段插入克隆位点后,标记基因失活,成为选择克隆子的依据。,氨苄青霉素抗性(ampicillin, Ampr) 卡那霉素抗性(kanamycin, Kanr) 四环素抗性(tetracycline, Tetr) 链霉素抗性(streptomycin, Strr) 氯霉素抗性(chloromycetin, Chlr),常用的选择标记:,3)在选择标记基因内,引入人工合成的多种限制酶连续酶切位点的DNA短序列,即多克隆位点(multiple cloning sites, MCS),
11、也称多酶接头(polylinker)。,同时删除重复的酶切位点,使其单一化。,4)根据外源基因克隆的不同要求,分别加装特殊的基因表达调控元件。,实验室用质粒多以少数几个野生型质粒为基础构建:,pSC101:8.8kb,拷贝数5,四环素抗性基因Tetr。,ColE1:6.5kb,拷贝数20-30(氯霉素诱导可达1000-3000),大肠杆菌素基因E1。,RSF2124:ColE1衍生质粒,氨苄青霉素抗性基因Ampr。,1、高拷贝质粒:,1)含有氯霉素可扩增的松弛型复制子结构,如ColE1、pMB1派生质粒、pBR系列;,用于克隆和扩增外源基因。,2)复制子经人工诱变,解除对质粒拷贝数的负控制作用
12、,使质粒在每个细胞中达数千拷贝。,如:pBR322:,ori-ColE1 Tetr-pSC101 Ampr-pSP2124,2、低拷贝质粒:,某些毒性基因的表达产物过多时,会严重影响宿主菌的正常代谢活动、导致宿主菌死亡,就需要低拷贝载体。,如pLG338/339、pHSG415等pSC101派生质粒,拷贝数10,用于表达某些毒性基因。,3、温敏质粒:,即温度敏感型复制控制质粒,在不同温度 下表现出拷贝数、整合等不同性质。,4、测序质粒:,高拷贝复制,含有多克隆位点(MCS),便于外源DNA的克隆与扩增,在MCS两端邻近区域,有通用引物互补序列,便于测序。,如:pUC18/19、M13 mp系列
13、、pGEM-T。,如:pUC18/19:,r,BamH I,pUC18,2,686 bp,Amp,lacZ,ori,GAATTCGAGCTCGGTACCCGGGGATCCTCTAGAGTCGACCTGCAGGCATGCAAGCTT,EcoR I,Sst I,Kpn I,Sma I,Xba I,Sal I,Pst I,Sph I,Hind III,ori-PBR322、Ampr-PBR322,pUC18/19正选择标记lacZ的显色原理:,底物:5-溴-4-氯-3-吲哚基-D-半乳糖苷 (X-gal),(-互补),5、整合质粒:,含整合酶编码基因和整合特异性位点序列,克隆在这种质粒上的外源基因进
14、入受体细胞后,能准确整合在受体细胞染色体DNA的特定位点。,便于外源基因的整合。,6、穿梭质粒(shuttle plasmid):,如:E.coli-酵母菌、E.coli-哺乳动物细胞穿梭质粒。,克隆的外源基因可不用更换载体、直接从一种受体菌转入另一种受体菌中复制并遗传。,含有两个亲缘关系不同的复制子结构、相应的选择标记基因,能在两种不同种属的受体细胞中复制并被检测。,E.coli-Pichia.pastoris穿梭质粒,E.coli-HEK293穿梭质粒,7、表达质粒:,在多克隆位点的上、下游,分别装有强化外源基因表达的转录、翻译、纯化元件,使外源基因能在受体细胞中高效表达、便于下游纯化。,
15、pGEM-3Z:,注意:T7和SP6启动子特异性地由噬菌体RNA聚合酶识别,相应的受体菌需表达噬菌体RNA聚合酶,如BL21(表达T7 RNA聚合酶)。,MCS,lacZ,PT7,ori,Ampr,PSP6,pET-3a:,pET-28a:,只有含启动子或终止子的外源DNA插入载体的合适位点,报告基因才能表达,表达量的高低直接反映表达调控元件的强弱。,8、探针质粒:,用于筛选表达调控元件,如启动子、终止子。,通常装有一个可定量检测表达程度的报告基因(如抗生素抗性基因),但缺少相应的启动子或终止子,因此本身不能表达报告基因。,质粒DNA的分离纯化,氯化铯密度梯度离心法,碱裂解法,沸水浴法,氯化铯
16、密度梯度离心法,沸水浴法,碱裂解法,氯化铯密度梯度离心法,质粒纯度高、周期长、设备要求高、溴乙锭污染;,碱裂解法,质粒纯度低、快速、操作简便;,沸水浴法,质粒纯度、操作周期介于氯化铯法和沸水浴法之间。,(三)噬菌体或病毒DNA,噬菌体(bacteriophage)或病毒(virus)是一类非细胞微生物,能高效率高特异性地侵染宿主细胞,然后或自主复制繁殖,或整合入宿主基因组中潜伏起来,而且在一定条件下这两种状态会相互转化。,噬菌体吸附在E.coli上,噬菌体释放、菌体裂解,T4噬菌体,The DNA is about 3,500 times longer than the viral parti
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