第二章基因工程工具酶限制酶.ppt
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1、第二章 基因克隆所需的工具酶,一、限制性内切酶(restriction enzyme) 1限制性核酸内切酶的发现 限制性核酸内切酶,是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列,并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。 根据1994年美国出版的分子生物学百科全书的统计数字,仅型核酸内切限制酶一项迄今就已从各种不同的微生物当中,分离出了2300种以上,可识别230种不同的DNA序列。 早在本世纪中期,以Arber等人对入噬菌体在大肠杆菌不同菌株上的平板培养效应的研究为基础,发现了原核生物体内存在着寄生控制的限制(restriction)和修饰(modif
2、ication)系统。,在限制修饰系统中限制作用是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用,破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等),使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制; 而生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后,通过修饰酶的作用:在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰,可免遭自身限制性酶的破坏,这就是限制修饰系统中修饰作用的含义。,2核酸内切限制酶的类型,3核酸内切限制酶的命名法 由于发现了大量的限制酶,所以需要有一个统一的命名法。HOSmith和DNathans(1973)提议的命名系统,已被广大学者所接受。他们建议的命名原则包括如下几点: (1) 用属名的头一个字母和种名的头两
3、个字母,组成3个字母的略语表示寄主菌的物种名称。例如,大肠杆菌(Escherichia coli)用Eco表示,流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。,(2) 用一个写在右下方的标注字母代表菌株或型,例如Ecok。 (3)如果一种特殊的寄主菌株,具有几个不同的限制与修饰体系,则以罗马数字表示。因此,流感嗜血菌Rd菌株的几个限制与修饰体系分别表示为HindI、HindII、HindIII等等。,(4)所有的限制酶,除了总的名称核酸内切限制酶R外,还带有系统的名称,例如核酸内切酶RHindIII。同样地,修饰酶则在它的系统名称之前加上甲基化酶M的名称。相应于核酸内
4、切酶RHindIII的流感嗜血菌Rd菌株的修饰酶,命名为甲基化酶M. HindIII。 在实际应用上,这个命名体系已经作了进一步的简化: 由于附有标注字母在印刷上很不方便,所以现在通行的是把全部略语字母写成一行。 在上下文已经交待得十分清楚只涉及限制酶的地方,核酸内切酶的名称R便被省去。,4.型核酸限制性内切酶的基本特性,它具有三个基本特性: a. 在DNA分子双链的特异性识别序列部位,切割DNA分子产生链的断裂; b. 2个单链断裂部位在DNA分子上的分布,通常不是彼此直接相对的; c. 因此,断裂的结果形成的DNA片段,也往往具有互补的单链延伸末端。,a. 识别位点: 绝大多数的II型核酸
5、内切限制酶,都能够识别由48个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。我们称这样的序列为核酸内切限制酶的识别序列。,切割位点的一个共同特点是,它们具有双重旋转对称的结构形式,换言之,这些核苷酸对的顺序是呈回文结构,例如:,5-CTGCA G-3,5-CTGCA G-3,(a)Pst I切割位点 , 切割后形成3OH的单链粘性末端,,3-G ACGTC-5, 3-G + ACGTC-5,,(b) EcoRI切割位点,切割后形成5-P的单链粘性末端,,5-G AATTC-3 5-G + AATTC-3,3-CTTAA G-5 3-CTTAA G-5,(c)EcoRV切割位点,切割后形成平末端。,5-GAT
6、ATC-3 5-GAT + ATC-3,3-CTA TAG-5 3-CTA TAG-5,b. 切割类型: 检验了非常大量的实验事例之后发现,由核酸内切限制酶的作用所造成的DNA分子的切割类型,通常是属于下述两种独特的排列方式之一: (1)两条链上的断裂位置是交错地、但又是对称地围绕着一个对称轴排列,这种形式的断裂结果形成具有粘性末端的DNA片段; (2)两条链上的断裂位置是处在一个对称结构的中心,这样形式的断裂是形成具有平末端的DNA片段。,c. 产生的末端特征: 我们所说的粘性末端是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构,它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来
7、。 平末端的DNA片段则不易于重新环化。,(2) 同裂酶 (isoschizomers) 有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列,这类酶特称为同裂酶(isoschizomers)。 同裂酶产生同样的切割,形成同样的末端。例如,限制酶Hpa和MspI是一对同裂酶,共同的靶子序列是CCGG。,与同裂酶对应的一类限制性内切酶,它们虽然来源不同,识别的靶序列也各不相同,但都能产生相同的粘性末端,特称为同尾酶。 常用的BamH I, Bcl I, Bgl I,Xho I就是一组同尾酶。它们切割DNA之后都形成由-GATC- 4个核苷酸组成的粘性末端,很显然,由同尾酶所产生的DNA片段,是能够通
8、过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的,因此在基因克隆实验中很有用处。,(3) 同尾酶 (isocaudamer),由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点,特称之为“杂种位点”(hybrid site)。但必须指出,这类杂种位点的结构,一般是不再被原来的任何一种同尾酶所识别的。例如: Sal I(5-G TCGAC-3)和 Xho I(5-C TCGAG-3)的消化片段相连,但所形成的重组片段(5-GTCGAG-3)则不能被上述2种酶的任一种酶识别和切割。但也有例外。,5影响核酸内切限制酶活性的因素 (1) DNA的纯度 核酸内切限制酶消化DNA底物的反应效率,在很大程度上是取决
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