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1、第五章 育种出发菌的分离筛选,2019/6/15,2,向菌种保藏机构索取有关的菌株。,菌种来源的途径,国内外著名的菌种保藏机构有: CCCCM (中国微生物保藏管理委员会) ATCC (美国典型菌种保藏中心) NCTC (英国国家典型菌种保藏所) IFO (大阪发酵研究所),2. 从一些发酵制品中分离目的菌株。容易筛选到较理想的菌株。 3. 由自然界采集样品中获得。如土壤、水、动植物 体等,从中进行分离筛选。容易发现新的菌株资源。,2019/6/15,3,菌株分离与筛选,菌株分离(separation):是将样品中混杂生长的各种微生物通过分离技术区分开,获得所需微生物的过程。 菌株筛选(scr
2、eening):在目的菌株分离的基础上,结合常规生产性能测定,选择目的产物合成能力相对高的菌株的过程。,2019/6/15,4,菌株分离和筛选,2019/6/15,5,第一节 含微生物样品的采集 第二节 含微生物样品的富集培养 第三节 微生物的分离 第四节 野生菌株筛选和目的产物鉴定,主要内容,2019/6/15,6,第一节 含微生物样品的采集,2019/6/15,7,含微生物样品的采集,一、从土壤中采样,1 根据土壤特点采集, 土壤有机质含量和通气状况,2019/6/15,8,典型的土壤层次结构,A soil profile,2019/6/15,9,不同土壤类型,2019/6/15,10,
3、地理条件 南方土壤比北方土壤中的微生物数量和种类都要多。, 季节条件 秋季是采样的良好季节, 土壤的酸碱度,2019/6/15,11,2 土壤中采样的方法,选点,取土,装袋,标记,用取样铲,将表层5cm左右的浮土除去,取5-25cm处的土样10-25g,,记录地点、土壤质地、植被名称、时间及其他环境条件,2019/6/15,12,二、根据微生物生理特点采样, 根据微生物营养类型,微生物的营养需要和代谢类型与其生长环境有着很大的相关性。,在筛选一些具有特殊性能的微生物时,需根据该微生物独特的生理特性到相应的地点采样。, 根据微生物的生理特性,2019/6/15,13,局部环境条件。如:海洋、肠道
4、、温泉、堆肥, 极端环境条件。 在绝大多数微生物所不能生长的高温、低温、高酸、高碱、高盐或高辐射强度的环境下,也有少数微生物存在,这类微生物被称为极端环境微生物。,三、特殊环境下采样,2019/6/15,14,第二节 含微生物样品的富集培养,2019/6/15,15,富集(enrichment)培养:是在目的微生物含量较少时,根据微生物的生理特点,设计一种选择性培养基,并创造有利的生长条件,使目的微生物在合适的环境下迅速生长繁殖,由原来自然条件下的劣势种变成人工环境下的优势种,以利分离到所需要菌株的过程。 富集培养主要根据微生物的碳源、氮源、pH、温度、需氧情况等生理因素加以控制。,2019/
5、6/15,16,一、控制培养基的营养成分,二、控制培养条件 通过对pH、温度及通气量等其他一些条件的特殊要求加以控制培养,达到有效的分离目的。 如 pH 细菌、放线菌:一般要求偏碱(pH7.2-7.5), 霉菌和酵母菌:要求偏酸(pH4.5-6)。,2019/6/15,17,三、抑制不需要的菌类,通过高温、高压、加入抗生素等方法减少非目的微生物的数量,使目的微生物的比例增加,达到富集的目的。 如: 硫乙醇酸钠造成厌氧环境,利于厌氧菌生长。 抗生素可抑制细菌生长,用于培养霉菌。,2019/6/15,18,2019/6/15,19,第三节 微生物的分离,2019/6/15,20,一、好气微生物的分
6、离,分离的方法很多,可分为“菌落纯”和“菌株纯”。,1 稀释涂布法,2019/6/15,21,2 划线分离法,2019/6/15,22,3 利用生化反应进行分离,2019/6/15,23,变色圈法:,2019/6/15,24,透明圈法,2019/6/15,25,脂酶产生菌的分离: 可采用固体平板变色圈法。 甘油三丁酸脂为底物,罗丹明 B 为指示剂,观察荧光圈; 制备维多利亚蓝乳脂琼脂培养基( pH 7.0 ) ,将样品涂布在平板上培养,阳性反应由粉红色变为蓝色。 改良双层法:平皿底层倒一层营养琼脂,把一片浸有被维多利亚蓝染色的乳脂的圆纸片铺在上面,然后覆盖一薄层含样品营养琼脂,保温培养,阳性反
7、应为蓝色。,2019/6/15,26,4 组织分离法,是从一些罹病组织或特殊组织中分离菌株的方法。, 对一般患病组织的分离方法,取样,无菌水洗涤,表面消毒,无菌水洗涤表面,植入平板,培养,镜检,分离纯化,2019/6/15,27, 食用菌孢子分离法,a. 多孢子分离法 孢子采集装置,2019/6/15,28,NT-88NE 显微操作系统 :(NARISHIGE) 适用于各种用途:转基因、遗传工程、人工受精、胚胎移植、和电生理学方面。,b. 单孢子分离法,2019/6/15,29,5 特殊菌类环保菌的分离,在分离某类污染物或废弃物的降解微生物时,通常采用以该物质为唯一碳源或氮源的培养基进行富集培
8、养,经过几个月的富集培养后,通过划线或涂布的方法进行在分离平板上分离、筛选。 该法在分离苯胺、DDT、甲基对硫磷(MP)、石油、甲胺磷等污染物降解菌时取得良好效果。,注意:环境污染物一般对微生物的生长有抑制作用,需要根据不同情况设计合理的筛选模型。,2019/6/15,30,二、厌气菌的分离, 加还原剂, 焦性没食子酸法, 平皿厌气培养法, 试管厌气培养法, 玻璃板隔绝空气培养法, 生物吸氧法,2019/6/15,31,厌氧培养袋,厌氧培养罐,厌氧工作站,厌氧操作仪器,2019/6/15,32,第四节 野生菌株筛选和目的产物鉴定,2019/6/15,33,一、初筛,定义:从大量分离到的微生物中
9、将能合成目的产物的微生物筛选出来的过程。筛选的方法有以下两种:,1 平板筛选,用于在分离纯化阶段随机挑选的菌株,用选择性平板进行定性测定。 特点:快速,简捷,效率高。,2019/6/15,34,2 摇瓶发酵筛选,用于经过定性筛选的菌种,通过摇瓶发酵进一步测定菌株相互之间产物活性的差异。 特点:比较接近发酵罐培养条件。,2019/6/15,35,二、复筛,将初筛得到的菌株进行发酵罐发酵,然后精确分析(如:电泳、色谱、质谱等精密仪器)测定其确切的产量水平,从而确定用于生产的菌株的过程。,复筛的工作:优化培养基成分;注意各种培养条件对菌体量或产物量的影响,并对各种影响因子进行组合实验,初步掌握该菌的适合培养条件。,三、筛选结果评价,2019/6/15,36,Thanks for your attention,2019/6/15,37,思考题,1、菌株分离和筛选的一般过程是什么? 2、利用生化反应进行菌株分离的主要方法有哪些?,
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