第五章蛋白质结构分析技术.ppt
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1、第五章 结构分析,蛋白质的氨基酸序列分析 生物质谱 X-射线晶体衍射技术 核磁共振 溶液中蛋白质分子构象的研究方法 蛋白质组,第一节 蛋白质和多肽的 氨基酸序列分析,Synopsis: 1. A practical approach to determining amino acid sequence requires a method to remove one amino acid at a time from a polypeptide chain. 2. This is achieved by the use of phenylisothiocyanate(异 硫氰酸苯酯)as the
2、 N-terminal labelling reagent, the Edman method. 3. This technique can only deal with chains of 20 to 60 amino acids, and most proteins are much larger. 4. To complete the process, selective hydrolysis of the polypeptide chain cuts very long polypeptides into specific fragments of more manageable si
3、ze.,N端序列分析 Sanger was the first person to determine a protein sequence, for insulin in 1953. The problem: after labelling the N-terminal amino acid, the polypeptide chain must be hydrolysed to isolate and identify the labelled amino acid. Whats needed is a way to remove the first amino acid without
4、having to hydrolyze the whole chain. This was solved by Per Edman, in Sweden in 1956, by using the reagent phenylisothiocyanate to label the N-terminal end of the polypeptide sample.,It works by cleaving the N-terminal AA off and leaving the rest of the peptide intact. The Edman method can be repeat
5、ed on the peptide remaining after the reaction, so this is a very effective method for obtaining AA sequence information. In fact the whole sequence of a peptide containing many AAs can be determined by Edman method.,降解反应分三步 偶联 PITC的异硫氰酸酯基与蛋白的自由氨基作用,产生苯氨基硫甲酰蛋白质。 裂解 PTC蛋白质在无水条件下酸裂解,切下反应的那个残基,暴露出下一个自由
6、氨基。 转化 ATZ氨基酸不稳定,在三氟乙酸水溶液条件下,转化成稳定的PTH氨基酸。 PTH氨基酸的鉴定 薄层层析,HPLC, GC(气相色谱),质谱分析等。,蛋白质N端测序仪器分析法: 1. 液相旋转杯序列仪 最早,很少用 2. 固相序列分析仪 有些氨基酸不能正确测定 3. 气相顺序仪 灵敏度很高,降低费用 4. 新型蛋白测序仪 快速可靠,高自动化,二. C端序列分析 适用 1. 鉴定重组蛋白是否正确表达 2. 大规模生产时质量控制 3. N端封闭蛋白的分析 4. DNA探针的设计 原理 化学试剂与蛋白质和多肽的羧基反应, 反应后的C末端衍生物被切割下来,通 过HPLC系统进行分析。,步骤
7、活化 酰胺化保护侧链羧基 烷基化 修饰Thr和Ser的羟基 裂解和衍生,第二节 生物质谱技术,Mass Spectrometry (MS) 是带电原子,分子 或分子碎片按质荷比(m/z)的大小顺序排列的图谱。 软电离技术: 离子化过程中不会破坏分子结构 电喷雾电离(ESI ) (Fenn et al. 1989) 基质辅助激光解析电离(MALDI) (Karas and Hillenkamp,1998) 质谱仪组成: 离子源,质量分析器,检测器,MALDI MS 电离基本原理: 将分析物分散在基质分子中并形成晶体。激光照射晶体时,使基质晶体升华,基质和分析物膨胀并进入气相。 The MALDI
8、 instrument is a matrix assisted laser desorption ionisation - time-of-flight (TOF) mass spectrometer,specifically for high throughput mass mapping of peptide digest fragments originating from proteins excised from 2D-gels i.e. proteomics.,MALDI离子源 电离技术的关键-基质的使用 基质的作用:样品离子形成过程中充当 质子化或去质子化试剂,使样品分子带 上
9、正电荷或负电荷。 常用基质: SA(芥子酸) DHB(龙胆酸) CCA(a-氰基-4-羟基肉桂酸),2. 质量检测器 1) 线性分析时间检测器(TOF) 优点:质量分析范围100Da100kDa 不足:分辨率和测量准确度低 2)反射分析时间检测器(RETOF) 分析质量数10kDa以下的离子 3. 样品制备,二. ESI MS 电离方法:靠强的电场使分子电离。分析 物溶液流经一个细细的进样针,针头上加 高电压用来产生正离子。高电压导致样品 液流分散为呈喷雾状的带电荷的微小滴。 当液滴从针尖通往入口时,在定向惰性气 体流作用下,溶剂蒸发,液滴缩小,电荷 密度增加,最终液滴爆裂,离子从液相中 释放
10、出来进入气相。 ESI MS 优势:可与多种分离技术联合 使用,如LC MS, HPLC MS 等。,It is operated with electrospray ionisation and samples can be introduced into the mass spectrometer by a number of different techniques.,The Q-Tof is a tandem mass spectrometer (MS/MS) with two analysers 。,The first being a quadrupole analyser the
11、second analyser is a reflectron time-of-flight analyser,In MS/MS mode, the two analysers are used together for structural studies by monitoring fragmentation patterns in molecules.,The TSQ 7000 is a tandem quadrupole mass spectrometer equipped with elecgtrospray and nanospray ionisation.,The TSQ 700
12、0 has a range of MS/MS capabilities: precursor ion scanning, product ion scanning and constant neutral loss scanning, which make the instrument ideal for the structural characterisation of a wide range of bio- and organic molecules, and is particularly useful for identifying post-translational modif
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- 第五 蛋白质 结构 分析 技术
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