第八章微生物的遗传.ppt
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1、第 八 章 微生物的遗传,第八章 微生物的遗传变异与育种,理想的工业发酵菌种应符合以下要求,遗传性状稳定; 生长速度快,不易被噬菌体等异种微生物污染; 目标产物的产量尽可能接近理论转化率; 目标产物最好能分泌到细胞外,以降低产物抑制并利于分离; 尽可能减少产物类似物的产量,以提高目标产物的产量并利于分离; 培养基成分简单、来源广、价格低廉; 对温度、pH、离子强度、剪切力等环境因素不敏感; 对溶氧的要求低,便于培养及降低能耗。,微生物的独特生物学特性,(1) 个体的体制极其简单; (2) 营养体一般都是单倍体; (3) 易于在成分简单的组合培养基上大量生长繁殖; (4) 繁殖速度快; (5)
2、易于积累不同的中间代谢产物或终产物; (6) 菌落形态特征的可见性和多样性; (7) 环境条件对微生物群体中各个个体作用的直接性和均一性; (8) 易于形成营养缺陷型; (9) 各种微生物一般都有相应的病毒; (10) 存在多种处于进化过程中的原始有性生殖方式;,微生物是研究现代遗传学和其它许多主要的生物学基本理论问题中最热衷的研究对象。 对微生物遗传规律的深入研究,不仅促进了现代分子生物学和生物工程学的发展,而且为育种工作提供了丰富的理论基础,促使育种工作从不自觉到自觉、从低效到高效、从随机到定向、从近缘杂交到远缘杂交的方向发展。,研究微生物遗传学的意义,遗传与变异的概念,遗传和变异是生物体
3、的最本质的属性之一。 遗传(heredity):亲代生物的性状在子代得到表现;亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。特点:具稳定性。 遗传型(genotype):又称基因型,指某一生物个体所含有的全部基因的总和;-是一种内在可能性或潜力。 遗传型 + 环境条件 表型 表型(phenotype):指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和;-是一种现实存在,是具一定遗传型的生物在一定条件下所表现出的具体性状。,变异(variation):生物体在外因或内因的作用下,遗传物质的结构或数量发生改变。变异的特点:a.在群体中以极低的几率出现,(一般为10-610-10);b.形状变化的幅
4、度大; c. 变化后形成的新性状是稳定的,可遗传的。 饰变(modification):指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。特点是:a.几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化;b.性状变化的幅度小;c.因遗传物质不变,故饰变是不遗传的。引起饰变的因素消失后,表型即可恢复。,例如:粘质沙雷氏菌:在25下培养,产生深红色的灵杆菌素;在37下培养,不产生色素;如果重新将温度降到25,又恢复产色素的能力。,遗传与变异的概念,第一节 遗传变异的物质基础,种质连续理论:18831889年间Weissmann提出。认为遗传物质是一种具有特定分子结构的化合物。 基因学说:1933
5、年摩尔根(Thomas Hunt Morgan)发现了染色体,并证明基因在染色体上呈直线排列,提出了基因学说,使得遗传物质基础的范围缩小到染色体上。 但染色体是由核酸和蛋白质两种长链高分子组成。20多种氨基酸经过不同排列组合,可以演变出的蛋白质数目几乎可以达到一个天文数字,而核酸的组成却简单得多,一般仅由4种不同的核苷酸组成,它们通过排列核组合只能产生较少种类的核酸,因此当时认为决定生物遗传型的染色体和基因,起活性成分是蛋白质。 DNA是遗传变异的物质基础的证明:1944年以后,先后有利用微生物为实验对象进行的三个著名实验的论证(肺炎球菌的转化试验、噬菌体感染试验、病毒的拆开与重建试验),才使
6、人们普遍接受核酸才是真正的遗传物质。,1928年,Griffith进行了以下几组实验: (1)动物实验 对小鼠注射活RII菌或死SIII菌 小鼠存活 对小鼠注射活SIII菌小鼠死亡 对小鼠注射活RII菌和热死SIII菌 小鼠死亡 抽取心血 分离 活的SIII菌,一、证明核酸是遗传物质基础的三个经典实验,研究对象:Streptococcus pneumoniae(肺炎双球菌) SIII型菌株:有荚膜,菌落表面光滑,有致病性 RII型菌株:无荚膜,菌落表面粗糙,无致病性,(一)经典转化实验(transformation),混合培养,RII型活菌,SIII型活菌,SIII型热死菌,RII型活菌,SI
7、II型活菌,健康,健康,健康,健康,健康,健康,健康,病死,病死,病死,Griffith 转化试验示意,(2)细菌培养实验,(3)S型菌的无细胞抽提液试验,以上实验说明:加热杀死的SIII型细菌细胞内可能存在一种转化物质,它能通过某种方式进入RII型细胞并使RII型细胞获得稳定的遗传性状,转变为SIII型细胞。,热死SIII菌不生长 活 RII 菌长出RII菌 热死SIII菌长出大量RII菌和10-6SIII菌,活R菌+S菌无细胞抽提液长出大量R 菌和少量S菌,+活RII菌,平皿培养,加S菌DNA 加S菌DNA及DNA酶以外的酶 加S菌的DNA和DNA酶 加S菌的RNA 加S菌的蛋白质 加S菌
8、的荚膜多糖,活R菌,长出S菌,只有R菌,1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M。McCarty从热死S型S. pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分,并在离体条件下进行了转化试验:,只有S型细菌的DNA才能将S. pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高,转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的,是遗传因子。,(二)噬菌体感染实验,A. D. Hershey和M. Chase, 1952年,(1)含32P-DNA的一组:放射性85%在沉淀中,上清液中含 15%放射性,沉淀中含 85%放射性,沉淀中含 25%放射性,以32S标记蛋白质外壳做噬菌
9、体感染实验,(2)含35S-蛋白质的一组:放射性75%在上清液中,上清液中含 75%放射性,(三)植物病毒的重建实验,为了证明核酸是遗传物质,H. Fraenkel-Conrat(1956)用含RNA的烟草花叶病毒(TMV)进行了著名的植物病毒重建实验。 将TMV在一定浓度的苯酚溶液中振荡,就能将其蛋白质外壳与RNA核心相分离。分离后的RNA在没有蛋白质包裹的情况下,也能感染烟草并使其患典型症状,而且在病斑中还能分离出正常病毒粒子。,MTV HRV,HRV MTV,(1)RNA(TMV) 蛋白质(HRV) (2)RNA(HRV) 蛋白质(TMV) 用两种杂合病毒感染寄主: (1)表现TMV的典
10、型症状病分离到正常TMV粒子 (2)表现HRV的典型症状病分离到正常HRV粒子。 上述结果说明,在RNA病毒中,遗传的物质基础也是核酸。,选用TMV和霍氏车前花叶病毒(HRV),分别拆分取得各自的RNA和蛋白质,将两种RNA分别与对方的蛋白质外壳重建形成两种杂合病毒:,(一)核酸存在的七个水平及质粒 细胞水平:存在于细胞核或核质体,单核或多核 细胞核水平: 原与真核生物的细胞核结构不同,核外DNA 染色体水平: 倍性(真核)和染色体数 核酸水平:在原核中同染色体水平、存在部分二倍体 DNA或RNA,复合或裸露,双链或单链 基因水平:具自主复制能力的遗传功能单位,长度与信息量,转录翻译 密码子水
11、平: 信息单位,起始和终止, 核苷酸水平: 突变或交换单位,四种碱基,二、遗传物质在细胞内的存在部位和方式,三、原核生物的质粒,定义:是一类小型闭合环状核外双螺旋DNA分子,能独立于细胞核进行自主复制。 大小:约为2-100106Dalton,上面携带有数个到数十个甚至上百个基因。 性质: 可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在(游离态),也可以通过交换掺入染色体上,以附加体(episome)的形式存在; 质粒是一种复制子(replicon),根据自我复制能力的不同,可把质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种,严紧型质粒的复制受细胞核控制,与染色体DNA复制相伴随,一般一个寄主细胞内只有少数
12、几个(1-5)个拷贝;松弛型质粒的复制不受细胞核控制,在染色体DNA复制停止的情况下仍可以进行复制,在细胞内的数量可以达到10-200个或更多。,可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个菌细胞中,使两个细胞都成为带有质粒的细胞;质粒转移时,它可以单独转移,也可以携带着染色体(片段)一起进行转移,所以它可成为基因工程的载体。 对于细菌的生存并不是必要的 功能多样化 功能:进行细胞间接合,并带有一些基因,如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。 重组:在质粒之间、质粒与染色体之间菌可发生。 存在范围:很多细菌如E.coli、Shigella、S.aureus、Strepto
13、coccus lactis、根癌土壤杆菌等 制备:包括增殖、裂解细胞、分离质粒与染色体和蛋白质等成分、去除RNA和蛋白质等步骤。 鉴定:电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶切图谱等方法,三、原核生物的质粒,几种代表性质粒,Figure. Representative FERTILITY PLASMID. A fertility plasmid carries the genes for conjugation as well as a number of other genes. In this figure the fertility plasmid also carries antibi
14、otic resistant genes.,1. F因子(fertility factor):又称致育因子或性因子,62106Dalton,94.5kb,相当于核染色体DNA2%的环状双链DNA,足以编码94个中等大小多肽,其中1/3基因(tra区)与接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中,决定性别。,最初发现于痢疾志贺氏菌(Shigella dysenteriae),后来发现还存在于Salmonella、Vibrio、Bacillus、Pseudomonas和Staphylococcus中。 R因子由相连的两个DNA片段组成,即抗性转移因子(resis
15、tence transfor factor, RTF )和抗性决定R因子(r-determinant),RTF为分子量约为11106Dalton,控制质粒copy数及复制,抗性决定质粒大小不固定,从几百万到100106Dalton以上。其上带有其它抗生素的抗性基因。 R-因子在细胞内的copy数可从12个到几十个,分为严紧型和松弛型两种,经氯霉素处理后,松弛型质粒可达20003000个/细胞。,2. R因子(resistance factor),产大肠杆菌素因子。 大肠杆菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的细菌素,能通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其它肠道细菌。其分子量约41
16、04-8104Dalton。大肠杆菌素都是由Col因子编码的。 Col因子可分为两类,分别以ColE1和ColIb为代表。 ColE1分子量约为5106Dalton,无接合作用,是多copy的; ColE1研究得很多,并被广泛地用于重组DNA 的研究和用于体外复制系统上。 ColIb分子量约为80106Dalton,它与F因子相似,具有通过接合作用转移的功能,属于严紧型控制,只有1-2个copy。 凡带Col因子的菌株,由于质粒本身编码一种免疫蛋白,从而对大肠杆菌素有免疫作用,不受其伤害。,3. Col因子(colicinogenic factor),4. Ti质粒(tumor inducin
17、g plasmid),即诱癌质粒。 存在于根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)中,可引起许多双子叶植物的根癌。 当细菌侵入植物细胞中后,在其细胞中溶解,把细菌的DNA释放到植物细胞中。这时,含有复制基因的Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合,破坏控制细胞分裂的激素调节系统,从而使它转变成癌细胞。 Ti质粒长200kb,是一个大型质粒。当前,Ti质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要性状的外源基因可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中,并进一步使之整合到植物染色体上,以改变该植物的遗传性,达到培育植物优良品种的目的。,是近年来在Rhizobi
18、um(根瘤菌属)中发现的一种质粒,分子量为200300106Dalton,比一般质粒大几十倍到几百倍,故称巨大质粒,其上有一系列固氮基因。,6. 巨大质粒(mega质粒),5. 降解性质粒,降解性质粒 只在假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码,从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。这些质粒以其所分解的底物命名,例如有分解CAM(樟脑)质粒,XYL(二甲苯)质粒,SAL(水杨酸)质粒,MDL(扁桃酸)质粒,NAP(奈)质粒和TOL(甲苯)质粒等。,基 因,原核生物基因系统: 启动子(基因) 操纵子 操纵子(基因) 基因调控系统 结构基因 调节基因,基因是能够表达
19、和产生基因产物(蛋白质或RNA)的DNA序列。,细胞水平:大部分或全部DNA都集中于细胞核或核质体中,不同种类微 生物或同种不同细胞中细胞核的数目不同; 染色体水平:真核微生物的每个细胞核内含有一定数量的染色体;而原核微生物中一个核质体就是一个裸露的、光学显微镜下不能看到的环状染色体。,一些真核生物和原核生物基因组的比较,生 物 单倍体的分子量 核苷酸 已知染色体数 约数(Da) 对数 基因数 人 32 35 1012 57 109 4000 黑腹果蝇 4 7.9 1010 8.0 107 50006000 粗糙脉孢菌7 2.8 1010 4.5 107 500 大肠杆菌 1 2.5 109
20、3.8 106 1027 噬菌体T4 1 1.1 108 2.0 105 135 噬菌体 1 3.2 107 4.8 104 35 噬菌体MS2 1 1.1 106 3.5 103 3,密码子(coden):由3个核苷酸顺序决定,负载遗传信息的基本单位 不对称转录:只有DNA双链的一股才作为有意义链被转录,这种现象又称不对称转录。 起始密码子:AUG,甲硫氨酸或甲酰甲硫氨酸 终止密码子:UAA、UGA、UAG,遗传密码 指DNA链上各个核苷酸的特定排列顺序,核外DNA的种类,核外染色体,真核生物的“质粒” 原核生物的质粒,线粒体 细胞质基因 叶绿体 (质体) 中心体 动 体 共生生物: 卡巴颗
21、粒 酵母菌的2m质粒,F因子 R因子 Col质粒 Ti质粒 巨大质粒 降解性质粒,第二节 基因突变和诱变育种,突变( mutation ) 指生物体的表型突然发生的可遗传的变化。 染色体畸变细胞学上可以看到染色体的变化 基因突变细胞学上看不到遗传物质的变化 突变体(mutant) 发生了突变的微生物细胞或菌株 野生型(wild type) 从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的 原始菌株,依表型的改变分为: 形态突变型 营养缺陷型因突变而丧失产生某种生物合成酶的能力,并因而成为必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。 发酵突变型丧失产生某种生物合成酶能力的突变型 抗性突变型因突变而产
22、生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性 条件致死突变型突变后在某种条件下可正常生长繁殖,而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型 抗原突变型因突变而引起的抗原结构发生改变 产量突变型,(一)基因突变的类型,按是否比较容易、迅速地分离到发生突变的细胞来分: 选择性突变株(selective mutant):具有选择标记(如营养缺陷性、抗性突变型、条件致死突变型),只要选择适当的环境条件,如培养基、温度、pH值等,就比较容易检出和分离到。 非选择性突变株(non-selective mutant):无选择标记(如产量突变型、抗原突变型、形态突变型),能鉴别这种突变体的惟一方法是检查大量菌落并找出差异。
23、,(二)突变率,定义:每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。 突变率为108是指该细胞在一亿次细胞分裂中,会发生一次突变。突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株(mutant,即突变型)的数目来表示。如一个含108个细胞的群体,当其分裂为2108个细胞时,即可平均发生一次突变的突变率也是108 。 突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数 突变是独立的。某一基因发生突变不会影响其它基因的突变率。在同一个细胞中同时发生两个基因突变的几率是极低的,因为双重突变型的几率只是各个突变几率的乘积。 由于突变的几率一般都极低,因此,必须采用检出选择性突变株的手段,尤其是采用检出营养缺陷型的恢复
24、突变株(back mutant或reverse mutant)或抗性突变株特别是抗药性突变株的方法来加以确定。,若干细菌某一性状的自发突变率,菌 名 突变性状 变率 E. coli 抗T1噬菌体 3 108 E. coli 抗T3噬菌体 1 107 E. coli 不发酵乳糖 1 1010 E. coli 抗紫外线 1 105 Staphylococcus aureus 抗青霉素 1 107 S. aureus 抗链霉素 1 109 Salmonella typhi 抗25g/L链霉素 1 106 Bacillus megaterium 抗异烟肼 5 105,(三)突变的特点,适用于整个生物界
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