第八章氨基酸产生菌的选育和发酵技术.ppt
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1、第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.1 选育抗代谢调节突变株 氨基酸发酵能否成功,产酸高低,取决于其反馈调节机制是否被解除和解除得是否彻底。氨基酸的发酵生产,最有效的方法就是造就从遗传角度解除氨基酸生物合成正常代谢调控机制的突变株。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.1 选育抗代谢调节突变株 (1)选育结构类似物抗性突变株 优点: 若不能从野生型、营养缺陷型得到生产菌株时,可以通过此法获得生产菌株;不受培养基成分的影响,生产较稳定。如有合适的结构类似物
2、,选育结构类似物抗性突变株,简单易得。易于保存而不易发生回复突变。只要在保存培养基中添加适量的结构类似物,就能有效的防止出现回复突变。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.1 选育抗代谢调节突变株 (1)选育结构类似物抗性突变株 筛选方法: 结构类似物添加到培养基中,选择性生长。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.1 选育抗代谢调节突变株 (1)选育结构类似物抗性突变株 机理: 作为假反馈调节剂:象对应氨基酸一样与变构酶的变构部位结合,抑制变构酶的活性。不可逆。 作为假反馈阻遏剂。象对应氨
3、基酸一样作为辅阻遏物,阻遏酶的合成。 抑制与对应氨基酸有关的氨酰基-tRNA合成酶的活性。 抑制对应氨基酸向细胞内摄取。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.1 选育抗代谢调节突变株 (1)选育结构类似物抗性突变株 育种实例: 苏氨酸结构类似物:a-氨基-羟基戊酸,黄色短杆菌,苏氨酸14g/L 赖氨酸结构类似物:S-(2-氨基乙基)-L-半胱氨酸,赖氨酸盐30g/L,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.1 选育抗代谢调节突变株 (2) 利用酶底物专一性宽的育种策略 找不到有效结构类似物,如果
4、有底物专一性宽的酶,则可利用该酶对其它底物的活性,选育代谢调节突变株。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.2 优先合成的变换 在分支合成途径的调节中,因分支点处的优先合成与反馈控制,优先合成的变换会引起一种终产物的过剩合成。 高丝氨酸脱氢酶(HD) 苏氨酸 抑制 蛋氨酸 蛋氨酸(过量),第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.3 增加前体物的积累 (1) 在分支合成途径中,切断其它合成途径,增加目的氨基酸的前体,提高目的氨基酸的产量。 (2) 其它终产物是目的氨基酸生物合成的前体,设法解除目的
5、氨基酸自身合成的反馈调节,也可设法解除对其前体物合成的调节。 苏氨酸是异亮氨酸的前体物。解除异亮氨酸、苏氨酸生物合成的反馈调节。 (3) 使分支点处的中间产物增多,导致目的氨基酸的积累增加。,第八章 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,谷氨酸发酵的代谢途径如下图所示,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.4 除去终产物 改变细胞膜渗透性 移去发酵液中的产物,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.5 利用特殊调节机制育种 (1) 多种产物控制机制的利用 黄色短杆菌,产生赖氨酸、蛋氨酸、苏氨酸、异亮氨
6、酸。 丧失高丝氨酸脱氢酶(HD),则赖氨酸积累。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.5 利用特殊调节机制育种 (2) 平衡合成的利用 在平衡合成机制中,由于第二个终产物的过剩逆转反馈控制,所以尽管存在反馈控制机制,也能积累目的氨基酸。 葡萄糖 磷酸烯醇式丙酮酸 丙酮酸 草酰乙酸 乙酰CoA 天冬氨酸 柠檬酸,黄色短杆菌中天冬氨酸与乙酰CoA形成的平衡合成,丧失柠檬酸合成酶,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.5 选育条件突变株 温度敏感型突变、抑制性突变、链霉素依赖性突变、低温敏感型突变等
7、,因环境条件的不同能显示野生型特性又能显示突变型特性的突变称为条件致死突变,条件突变。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.7 选育不生产副产物的突变株 (1) 有共用前体物的其它分支途径或目的氨基酸是其它氨基酸合成的前体物时,应切断其它分支途径或目的氨基酸向其它氨基酸合成的代谢流。 (2) 存在有目的氨基酸分解途径时,应选育丧失目的氨基酸分解酶的突变株。 (3) 副生氨基酸,特别是不利于目的氨基酸精制的副生氨基酸,应设法切断其代谢流。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.1 氨基酸产生菌的选育和定向育种策略,8.1.9 氨基酸产生菌的
8、定向育种途径 发酵生产氨基酸,多采用营养缺陷型、抗结构类似物或具有多重遗传标记的突变株。避免盲目性。 研究目的氨基酸生物合成途径、遗传控制、代谢调节与关键酶。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.2.1 利用原生质体融合技术选育氨基酸产生菌,原生质体融合操作步骤 标记菌株的选择 原生质体的制备 原生质体的再生 原生质体的融合 融合子的选择 实用性菌株的筛选,8.2 用细胞内基因重组手段选育氨基酸产生菌,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.2 用细胞内基因重组手段选育氨基酸产生菌,8.2.2 利用转导法选育氨基酸产生菌 转导法-通过温和型噬菌体为媒介,将供体细胞中的DNA片段携带到受
9、体细胞中,从而获得了供体细胞部分遗传性状的现象。 (1) 选育组氨酸产生菌 野生菌 组氨酸酶缺陷菌株Hd-16 亚硝基胍 突变株HdMhr581 突变株HdTr142/HdTr51 (抗2-甲基组氨酸) (抗1,2,4-三唑-3-丙氨酸) 噬菌体PS20 组氨酸产生菌HT2892,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.2 用细胞内基因重组手段选育氨基酸产生菌,8.2.3 利用原生质体转化法选育氨基酸产生菌 转化法-受体细胞直接吸收供体细胞的DNA片段,并将它整合到自己的基因组中,从而获得了供体细胞部分遗传性状的现象。 氨基酸产生菌一般为非感受态细胞,需先制成原生体,再转化。,第八章 氨基酸
10、产生菌的选育和发酵技术,8.3 用重组DNA技术构建氨基酸工程菌,8.3.1 概述,重组DNA技术(基因工程) 操作步骤: 工具酶和载体的选择 目的基因的制备 化学合成法、基因组DNA文库、cDNA文库、PCR DNA体外重组和外源基因的扩增与表达 重组DNA导入受体菌 重组体的筛选,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.3 用重组DNA技术构建氨基酸工程菌,8.3.1 概述,(1) 工具酶 限制性内切酶 EcoR I GAATTC CTTAAG 目前已发现200多种 其它工具酶:DNA聚合酶、DNA连接酶、末端转移酶、T4连接酶、反转录酶等,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.3
11、用重组DNA技术构建氨基酸工程菌,8.3.1 概述,(2) 寄主载体系统 脱离染色体的基因不能复制,需要无性繁殖系。 (3) 目的基因的制备与克隆 (4) 转化系统 (5) 目的基因的表达,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.3 用重组DNA技术构建氨基酸工程菌,8.3.2 赖氨酸产生菌的构建 赖氨酸产生菌AJ11779 增殖 提取染色体DNA 质粒pUB110 EcoR I EcoR I 连接 枯草杆菌AJ1315 重组质粒 扩增 感受态细胞 DNA 转化子AJ11780 鉴定,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.3 用重组DNA技术构建氨基酸工程菌,8.3.3 苏氨酸产生菌的构
12、建,8.3.4 其它氨基酸产生菌的构建,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.4 氨基酸工程菌的稳定化,8.4.1 防止回复突变的产生与增殖 (1) 定向选育增加遗传标记的产生菌株 (2) 选育遗传性稳定的菌株 在容易出现回复突变株的培养基中反馈传代,单细胞分离,选择不易出现回复突变株的菌株。 用理化诱变因子反复诱变 (3) 改良培养基的组成 种子培养基和保存培养基营养丰富。 (4) 添加药剂,抑制回复突变株的产生与增殖 (5) 生产管理 定期纯化,并作遗传标记检查。菌种保藏。尽量减少传代次数,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.4 氨基酸工程菌的稳定化,8.4.2 使用改善了世代时
13、间的产生菌株,8.4.3 防止噬菌体的污染,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.5 发酵条件对氨基酸发酵的影响,8.5.1 供养条件对谷氨酸族氨基酸生产的影响 由谷氨酸生物合成谷氨酰胺、脯氨酸、精氨酸等谷氨酸族氨基酸,其生物合成与三羧酸循环关系密切,产物积累受供氧条件的影响极大。 供氧充足,产酸量大;反之,产量低。,第八章 氨基酸产生菌的选育和发酵技术,8.5 发酵条件对氨基酸发酵的影响,8.5.2 供养条件对天冬氨酸族氨基酸生产的影响 天冬氨酸族氨基酸:赖氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、天冬氨酸等 供氧充足,酸产量高;反之,发酵生产受到轻微抑制。,亮氨酸、苯丙氨酸和缬氨酸发酵,供氧较低,酸产量
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