第十一章疾病产生的分子基础bbbpowerpointbpresentation.ppt
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1、第十一章 Chapter11 疾病产生的分子基础 Molecular Basis of Diseases Formation,基因结构与表达异常与疾病,人类疾病如白血病、恶性肿瘤、糖尿病、神经退行性疾病、心脑血管、高血压等的发生和发展都涉及到有关蛋白质及其复合物的结构、功能和相互作用异常。,人体内蛋白质分子结构和功能的异常是疾病的发生和发展的主要原因 。,基因结构与表达异常与疾病,细胞微环境的变化,包括基因甲基化的变异以及各种特定基因表达的异常都和疾病发生有关。越来越多的证据显示基因表达的异常将导致各种疾病的发生,尤其是肿瘤形成。,基因结构与表达异常与疾病,人的基因组中有相当一部分基因,甚至染
2、色体片段,在精子或卵细胞形成过程中,会因某种结构修饰而不能表达,称为基因印迹(genetic imprinting)。这种在生物进化中形成的、有规律而又受控的基因失活是机体中基因表达调节的一种重要方式。基因印迹的异常往往会导致多种遗传性疾病。,一、基因结构与表达异常与疾病发生,1基因结构改变,2细胞间信号异常,3 细胞内因素,(一) 基因突变的多种类型,点突变是单个碱基的改变 缺失是一个或多个核苷酸的丢失 插入是一个或多个核苷酸的增加 倒位是一段核苷酸序列方向倒转 基因突变还分为配子突变与体细胞突变 动态突变指串联重复拷贝数随世代的传递而改变,基因突变,由于体内外各种因素改变了某基因特定的DN
3、A序列碱基组成和排列顺序,导致DNA一级结构发生改变,改变了基因结构;其分子机制可以是替换、插入或缺失,因而产生不同的突变类型。,基因突变的类型,点突变:单个碱基的改变 在基因一级结构的某个位点上,一种碱基被另一种碱基取代。,分为: 转换 (transition) 颠换 (transversion),基因突变的类型,缺失(delelation)是一个或多个核苷酸的丢失:在基因一级结构中某个位点上,一个核苷酸或一段核苷酸序列丢失造成的基因结构改变。,3. 插入(insertion),基因突变的类型,倒位是一段核苷酸序列方向倒转:基因内部的DNA序列重组,使一段DNA序列的方向倒转。 配子突变与体
4、细胞突变 动态突变指串联重复拷贝数随世代的传递而改变(dynamic mutation),碱基置换突变 (substitution mutation),(二) 不同的基因突变引起不同的遗传效应,a. 同义突变 (consense mutation),b. 错义突变 (missense mutation),c. 无义突变 (nonsense mutation),d. 终止密码子突变或延长突变,e. 起始密码子突变(initiation codon mutation),f. 非编码序列点突变 (point mutation in noncoding sequence),同义突变(same sens
5、e mutation):密码子发生改变, 但所编码的氨基酸不变。,例如:CUU CUC CUG 亮氨酸,错义突变(missense mutation)指DNA改变后mRNA中相应密码子发生改变,编码另一种氨基酸,使蛋白质中的氨基酸发生改变。,错义突变结果产生异常蛋白质和酶。但也有不少基因由于错义突变产生部分降低活性和异质组分的酶,不完全抑制了催化反应,这种基因称为漏出基因(leaky gene)。有些错义突变不影响蛋白质或酶的生物活性,不表现出明显的表型效应。,由于一对或几对碱基对的改变而使决定某一氨基酸的密码子变成一个终止密码子的基因突变叫无义突变 (nonsense mutation) 。
6、,亮氨酸的密码子UUA,中间的U变为A这样一个碱基变化就会成为(终止密码子)UAA。,酪氨酸的密码子是UAC,置换突变使UAC变为密码子UAG后翻译便到此停止。,当DNA分子中一个终止密码发生突变,成为编码氨基酸的密码子时,多肽链的合成将继续进行下去,肽链延长直到遇到下一个终止密码子时方停止,因而形成了延长的异常肽链,这种突变称为终止密码突变(termination codon mutation)或延长突变(elongtion mutation)。,当基因内部不同位置上的不同碱基发生了两次突变,其中一次抑制了另一次突变的遗传效应,这种突变称为抑制基因突变(suppressor gene mut
7、ation)。,如单纯6谷氨酸缬氨酸,则可产生HbS病,往往造成死亡。但Hb Harlem临床表现却较轻,即73的突变抑制了6突变的有害效应。,(2) 缺失或插入突变(deletion or insertion mutation) a. 密码子缺失或插入(codon deletion or codon insertion) b. 移码突变(frame-shift mutation) c. 整基因或大片段缺失 (deletion of a whole gene or a large segment) (3) 融合突变(fusion mutation) 细胞减数分裂时同源染色体不等交换而致基因间错
8、位配对, 产生两种含不同等位基因的染色体。,移码突变(frame-shift mutation):指DNA链上插入或丢失1个、2个甚至多个碱基(但不是三联体密码子及其倍数),在读码时,由于原来的密码子移位,导致在插入或丢失碱基部位以后的编码都发生了相应改变。移码突变造成的肽链延长或缩短,取决于移码终止密码子推后或提前出现。,(4) 基因突变影响 hnRNA 的剪接,基因突变发生在 hnRNA 的一级结构上特定的剪接位点上,导致 hnRNA 的剪接错误,产生异常的 mRNA,最终产生异常的蛋白表达产物,改变生物性状。,(三) 结构基因改变导致蛋白质变化引起疾病,1. 血红蛋白病 (hemoglo
9、binopathy): 血红蛋白(hemoglobin, Hb)的结构特点 珠蛋白(globin)基因的时、空特异性表达,血红蛋白结构,血红蛋白是由4条肽链(两个和两个链)组成的。每条肽链都类似于肌红蛋白的肽链,都结合一个血红素。,血红蛋白的脱氧(T)和氧合(R)构象在氧的亲和性方面有很大区别。由于结构上的相互作用是与它的三级和四级结构有关,所以血红蛋白在结合氧的过程中显示出别构效应和协同性。,血红蛋白分子一级结构上的轻微差别就可能导致功能上的很大不同,正常成年人血红蛋白中的链的第六位的谷氨酸残基被缬氨酸取代就会导致镰刀形细胞贫血病的异常血红蛋白HbS 的生成。,血红蛋白病镰刀形细胞贫血症,(
10、1) 人-珠蛋白基因簇及珠蛋白基因结构,(2) 人-珠蛋白基因簇及珠蛋白基因结构,血红蛋白病类型,异常血红蛋白: 珠蛋白结构(质)变异,导致贫血。,地中海贫血: 珠蛋白合成(量)减少,又称珠蛋白合成障碍性贫血。,(四) 常见单基因病:,疾病名称 发病频率( ) 遗传方式 致病基因 典型症状 血友病A 0.1 X连锁 凝血因子 不规则出血 血友病B 0.03 X连锁 凝血因子 不规则出血 杜氏肌营养不良 0.3 X连锁 肌营养因子 肌萎缩 贝氏肌营养不良 0.05 X连锁 肌营养因子 肌萎缩 脆性X综合征 0.5 X连锁 FMR1 智力障碍 舞蹈病 0.5 常染色体显性 舞蹈病因子 痴呆 神经纤
11、维 0.4 常染色体显性 NF-1,2 癌变 珠蛋白生成障碍性贫血 0.05 常染色体隐性 珠蛋白基因簇 贫血 镰刀细胞贫血 0.1 常染色体隐性 珠蛋白基因 贫血, 局部缺血 苯丙酮酸尿 0.1 常染色体隐性 苯丙氨酸羟基化酶 无苯丙酮酸代谢能力 囊性纤维化 0.4 常染色体隐性 CFTR 进行性肺损伤及其他,基因突变类型 异常Hb 氨基酸变化 临床特征 错义突变 Hb Shuangfeng 27GluLys(GAGAAG) 不稳定Hb病 Hb S 6GluVal(GAGGUG) 镰刀型细胞贫血 Hb Bibba 136LeuPro(CUGCCA 不稳定Hb病 无义突变 Hb Mckees
12、Rocks 145Tyr终止(UAUUAA) 不稳定Hb病 终止密码突变 Hb Constant Spring 142UAACAA- - -地贫 (延长:142Gln- -173UAA) 密码子缺失 Hb Gun Hill 9195缺失 不稳定Hb病 密码子插入 Hb Grady 118与119间插入3个氨基酸 无明显症状 移码突变 Hb Tak 147UAAACU AA- 不稳定Hb病 -158UAA(Thr) 融合突变 Hb Lepore-Boston 87(Gln)-116(His) -地贫 Hb Kenya 81(Leu)-86(Ala) -地贫,囊性纤维化病(cystic fibro
13、sis, CF),囊 性 纤 维 化 病,囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTCR)的基因突变所致,产生缺陷型蛋白,致使使氯离子的转运障碍,黏液在呼吸道黏膜内淤滞,黏膜形成囊性增生,造成呼吸道堵塞;因反复感染,导致患者呼吸衰竭而死亡。,Gene therapy of CF,将重组CFTCR基因cDNA-病毒载体,用涂布鼻腔、或喷雾吸入气管及肺部等方法,转入患者呼吸道上皮细胞中,获得正常CFTCR基因的表达,纠正Cl转运缺陷,减少黏液分泌。,(五)细胞间信号异常导致基因表达异常引起疾病,人体各细胞间通过激素、神经递质、旁分泌信号等保持细胞间的联系,调节彼此的代谢。基因表达也受到细胞间信号的调控。
14、AFP 接受异常的细胞增殖信号成为肝癌发生的重要因素。 粉尘刺激 肺支气管上皮、肺泡巨噬细胞 分泌TGF-1 成纤维细胞 促细胞分裂和ECM 蛋白基因表达 ECM 增加 矽肺发生,(六)细胞内因素导致基因表达异常引起疾病,异常的细胞内信号 高血糖 DAG PKC ACE Ang ,病原生物基因的体内表达,异常的DNA甲基化 hCG5转录起始区低甲基化非滋养层细胞hCG 受体结合 cAMP Tumor ,二、基因结构和表达与疾病的研究策略,1通过结构分析确定基因变异 核糖核酸酶切分析、杂合双链分析、 化学切割错配、酶促切割错配,3通过功能学研究确定致病基因 转基因技术、基因敲除、 反义技术、基因
15、诱导超表达,2基因表达水平分析 差异显示、抑制消减杂交、基因表达系列分析,核糖核酸酶切分析,基本原理: 在一定条件下,异源双链核酸分子RNA:RNA或RNA:DNA中错配碱基可被核糖核酸酶RNase识别并切割,通过凝胶电泳分析酶切片段的大小,即可确定错配的位置。,核糖核酸酶切分析(RNase cleavage), Watterson et al., J Clin Microbiol (1998) Mutation scanning Nested PCR of wild type and patient Inner promoter primers SP6 and T7 In vitro tra
16、nscription of each RNA strand RNA:RNA heteroduplexes RNA proficiency required Cleave with RNase 1 and T1 (not RNase A) Gel detection; could include isotope incorporation,核糖核酸酶切分析(RNase cleavage),缺点: 当RNA探针上错配的碱基为嘌呤时,核糖核酸酶切割效率低甚至不切割; 分析DNA的一条链,突变检出率为 30%;同时分析DNA的两条链,突变检出率为 70%; 需要制备特异性的RNA探针,杂合双链分析法
17、(heteroduplex analgsis, HA),直接在非变性凝胶上分离杂交的突变型-野生型DNA双链。由于突变型和野生型DNA形成的异源杂合双链DNA在其错配处会形成单链环形突起,在非变性凝胶中电泳时,会产生与相应同源双链DNA不同的迁移率。,杂合双链分析( heteroduplexes analysis),Lanes 10 and 11 show the mixture of M and S samples with the control samples where besides the homoduplex line we are able to observe a heter
18、oduplex line (top arrow).,化学切割错配法 (Chemical cleavage of mismatch, CCM),基本原理: 将待测含DNA片段与相应的野生型DNA片段或RNA片段混合变性杂交,在异源杂合的双链核酸分子中,错配的C能被羟胺和哌啶切割,错配的T能被四氧化锇切割,经变性凝胶电泳可确定是否存在突变。,化学切割错配法,特点: 突变检出率高; 如使用荧光检测系统,灵敏度较高; 可检测长度达 2Kb的核酸片段; 步骤多、费时、有毒; 碳化二亚胺检测法,酶促切割错配 (enzyme mismatch cleavage ),polymorphisms can be
19、identified by EMC in DNADNA heteroduplexes. T4 Endo nuclease VII samples are PCR amplified, denatured and hybridized to create DNADNA heteroduplexes Enzymes cleave adjacent to the mismatch and products are resolved via gel or capillary electrophoresis. the cleavage enzymes often nick complementary r
20、egions of DNA as well. ( increases background noise, lowers specificity, reduces the pooling capacity of the assay),RFLP-Restriction Fragment Length Polyhmorphism,RFLPs,Microsatellite repeats,差异显示技术(mRNA differential display reverse transcription chain reaction, DDRT-PCR),在不同的生长时期、在个体的发育与分化的不同阶段、在生物
21、体对疾病的反应以及不同的环境下调控基因的表达是不同的,这就是基因的差别表达(differential expression)。,原理:利用两组特殊的引物对差别表达的基因进行扩增。 3端引物:利用mRNA的poly A尾巴设计。根据mRNA结构分析知道,poly A尾巴之前的两个碱基只有12种可能的排列组合:,根据这12种排列组合,设计12种不同的引物,这样就将所有mRNA分成了12组。这些引物由1112个T及两个其它的碱基组成,用通式5-T11MN或5-T12MN表示,M为A、G、C的任一种,N为A、G、C、T的任一种。这种引物称锚定引物。 5端引物:5端为10个碱基(10-mer)组成的随机
22、引物。每一个随机引物都可能与总mRNA中的某一些分子发生杂交,杂交位点也可能在mRNA的不同位点上。 用一种3锚定引物和一种5随机引物进行扩增,可获得50100条100500bp的DNA扩增带。为了要寻找更多的DNA差异带,应使用全部的12种锚定引物以及尽可能多的5随机引物。,抑制性差减杂交 (SSH) - Diatchenko L, et al. PNAS 1996; 93:6025-6030 Suppression subtractive hybridization: a method for generating differentially regulated or tissue-sp
23、ecific cDNA probes and libraries,抑制性差减杂交 (suppressive subtractive hybridization, SSH) 原理 SSH是差减杂交与PCR结合的快速分离差异基因的方法。运用杂交动力学原理,丰度高的单链DNA退火时产生同源杂交的速度快于丰度低的单链DNA,使不同丰度的单链DNA得到均衡;抑制PCR利用链内退火优于链间退火的优点,使非目的基因片段两端反向重复序列在退火时产生类似发卡的互补结构, 无法作为模板与引物配对,选择性地抑制了非目的基因片段的扩增,从而使目的基因得到富集、分离。,方法 提取实验组和对照组mRNA合成双链cDNA,
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