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1、第六节、毛细管电泳(CE),一、概述 1、高效毛细管电泳技术简介 毛细管电泳(capillary electrophoresis)又称高效毛细管电泳(high-performance capillary electrophoresis, HPCE),是20世纪80年代中期问世的一种高效液相分离法,是经典电泳技术与现代微柱分离相结合的产物。是离子或荷电粒子以电场为驱动力,在毛细管中按其淌度或/和分配系数不同进行高效、快速分离的一种电泳新技术。,2、高效毛细管电泳技术基本原理 最基本的高效毛细管电泳仪器如图1所示:,图1 毛细管电泳基本仪器结构示意图 HV. 高压电源(030kV); C. 毛细管
2、;E. 电极槽;Pt. 铂电极;D. 在柱检测器;S. 样品; DA. 数据采集处理系统,样品在毛细管中的分离过程如图2所示:,分离过程: 电场作用下,毛细管柱中出现:电泳现象和电渗流现象,带电粒子的迁移速度=电泳+电渗流;两种速度的矢量和。 正离子:两种效应的运动方向一致,在负极最先流出; 中性粒子无电泳现象,受电渗流影响,在阳离子后流出; 阴离子:两种效应的运动方向相反。电渗流 电泳时,阴离子在负极最后流出,在这种情况下,不但可以按类分离,除中性粒子外,同种类离子由于受到的电场力大小不一样也同时被相互分离。,图2 毛细管电泳分离示意图,3、毛细管电泳的特点 由于毛细管具有良好的散热效能,允
3、许在窄内径毛细管两端加上高达30kV的高电压,分离毛细管的纵向电场强度可达400V/cm以上,可以在很短的时间内达到很高的分离效率,具有以下特点: (1)分离速度快(高压、高电场强度) 在3.1min内分离36种无机及有机阴离子,4.1min内分离了24种阳离子 (2)分离效率高(N105106) (3)运行成本低 (4)样品与试剂消耗量少(150nL) (5)可供选择的分离模式多,应用范围广 (6)分离一般在水溶液介质中进行 (7)方法简单,仪器自动化程度高 (8)环境污染小,表1 高效毛细管电泳与高效液相色谱性能比较,4、毛细管电泳简单历史,(1)1967年Hjerten首先报道了开管毛细
4、管电泳,后来Virtanen和Mikkers先后分别在约200 m内径的玻璃或Teflon毛细管中进行电泳,这些是毛细管电泳的最初期工作。 (2)1981年,Jorgenson和Lukacs使用75 m内径100cm的玻璃毛细管在30kV的高电压下进行电泳,获得了数十万理论塔板数的高分离效率,使毛细管电泳技术有了突破性进展。,(3)1984年,Terabe发展了毛细管电泳的新分支-毛细管胶束电动色谱(MEKC) (4)1987年, Hjerten提出了毛细管等电聚焦(CIEF)。同年,Cohen和Karger发表了毛细管凝胶(CGE)的研究工作。到此为止,毛细管电泳所有传统分离模式全部诞生,标
5、志着毛细管电泳技术的发展成熟。,图3 常用几种型号的高效毛细管电泳仪,二、高效毛细管电泳仪器流程和主要部件,电压:030kV; 分离柱不涂敷任何固定液; 紫外或激光诱导荧光检测器; (可检测到:10-1910-21 mol/L),图 4 高效毛细管电泳流程图,图 5 高效毛细管电泳基本装置,1.高压电源,(1)030 kV 稳定、连续可调的直流电源; (2)具有恒压、恒流、恒功率输出; (3)电场强度程序控制系统; (4)电压稳定性:0.1%; (5)电源极性易转换; 2. 毛细管柱 (1)材料:石英:各项性能好;玻璃:光学、机械性能差; (2)规格:内径2075m,外径350400m;长度=
6、1m 3. 缓冲液池 化学惰性,机械稳定性好 4. 检测器 要求:具有极高灵敏度,可柱端检测; 检测器、数据采集与计算机数据处理一体化;,类型 检测限/mol 特点 紫外-可见 10-1310-15 加二极管阵列,光谱信息 荧光 10-1510-17 灵敏度高,样品需衍生 激光诱导荧光 10-1810-20 灵敏度极高,样品需衍生 电导 10-1810-19 离子灵敏,需专用的装置,表 2 各种类型检测器性能列表,5、高效毛细管电泳进样方式 进样量:毛细管长度的1%-2%;纳升级、非常小 (1) 流体力学进样方式 a、进样端加压 b、出口端抽真空 c、虹吸进样,(2)电动进样方式 毛细管一端插
7、入样品瓶,加电压;,特点: 进样不均:电歧视现象,淌度大的离子比淌度小的进样量大; 离子丢失:淌度大且与电渗流方向相反的离子可能进不去; 特别适合黏度大的试样,(3) 扩散进样 试样通过扩散作用进入分离柱端口处,三、高效毛细管电泳理论( theory of HPCE ) (一)高效毛细管电泳(HPCE)基本原理 电泳是指带电离子在电场中的定向移动,不同离子具有不同的迁移速度,当带电离子以速度 在电场中移动时,受到大小相等、方向相反的电场推动力和平动摩擦阻力的作用。 淌度 :单位电场强度下的平均电泳速度,(二)电渗现象与电渗流(electroosmosis and electroosmotic
8、flow),1、电渗流现象 当固体与液体接触时,固体表面由于某种原因带一种电荷,则因静电引力使其周围液体带有相反电荷,在液-固界面形成双电层,二者之间存在电位差。,图 6 毛细管电泳中的电渗现象,当液体两端施加电压时,就会发生液体相对于固体表面的移动,这种液体相对于固体表面的移动的现象叫电渗现象。 电渗现象中整体移动着的液体叫电渗流(electroosmotic flow ,简称EOF)。,2、HPCE中的电渗现象与电渗流 石英毛细管柱,内充液pH3时,表面电离成-SiO-,管内壁带负电荷,形成双电层。 在高电场的作用下,带正电荷的溶液表面及扩散层向阴极移动,由于这些阳离子实际上是溶剂化的,故
9、将引起柱中的溶液整体向负极移动,速度电渗流。,图 7 毛细管电泳中电渗现象和电渗流,3、HPCE中电渗流的大小与方向 (1)电渗流大小计算公式 电渗流的大小用电渗流速度电渗流表示,取决于电渗淌度和电场强度E。 即 电渗流 = E 电渗淌度取决于电泳介质及双电层的Zeta电势,即 = 0 0真空介电常数;介电常数;毛细管壁的Zeta电势(扩散层电势) 。 电渗流 = 0 E 实际电泳分析,可在实验测定相应参数后,按下式计算 电渗流 = Lef/teo Lef 毛细管有效长度; teo电渗流标记物(中性物质)的迁移时间。,(2) HPCE中电渗流的方向 电渗流的方向取决于毛细管内表面电荷的性质:
10、内表面带负电荷,溶液带正电荷,电渗流流向阴极; 内表面带正负电荷,溶液带负电荷,电渗流流向阳极; 石英毛细管;带负电荷,电渗流流向阴极 改变电渗流方向的方法: (1)毛细管改性 表面键合阳离子基团; (2)加电渗流反转剂 内充液中加入大量的阳离子表面活性剂,将使石英毛细管壁带正电荷,溶液表面带负电荷。电渗流流向阳极。,4、HPCE中电渗流的流形 电荷均匀分布,整体移动,电渗流的流动为平流,塞式流动(谱带展宽很小); 液相色谱中的溶液流动为层流,抛物线流型,管壁处流速为零,管中心处的速度为平均速度的2倍(引起谱带展宽较大)。,图 8 毛细管电泳电渗流流形和液相色谱流形的比较,5、HPCE中电渗流
11、的作用,电渗流的速度约等于一般离子电泳速度的57倍; 各种电性离子在毛细管柱中的迁移速度为: + =电渗流 + +ef 阳离子运动方向与电渗流一致; - =电渗流 - -ef 阴离子运动方向与电渗流相反; 0 =电渗流 中性粒子运动方向与电渗流一致; (1)可一次完成阳离子、阴离子、中性粒子的分离; (2)改变电渗流的大小和方向可改变分离效率和选择性,如同改变LC中的流速; (3)电渗流的微小变化影响结果的重现性; 在HPCE中,控制电渗流非常重要。,(三)HPCE中影响电渗流的因素 1、电场强度的影响 电渗流速度和电场强度成正比,当毛细管长度一定时,电渗流速度正比于工作电压。 2、毛细管材料
12、的影响 不同材料毛细管的表面电荷特性不同,产生的电渗流大小不同;,图 9 不同材料毛细管pH对电渗流的影响,3、电解质溶液性质的影响 (1)溶液pH的影响 对于石英毛细管,溶液pH增高时,表面电离多,电荷密度增加,管壁zeta电势增大,电渗流增大,pH=7,达到最大; pH3,完全被氢离子中和,表面电中性,电渗流为零。分析时,采用缓冲溶液来保持pH稳定。 (2)阴离子的影响 在其他条件相同,浓度相同而阴离子不同时,毛细管中的电流有较大差别,产生的焦耳热不同。 缓冲溶液离子强度,影响双电层的厚度、溶液黏度和工作电流,明显影响电渗流大小。缓冲溶液离子强度增加,电渗流下降。,图 10 离子强度对电渗
13、流的影响,4、温度的影响,毛细管内温度的升高,使溶液的黏度下降,电渗流增大。 温度变化来自于“焦耳热”; 焦耳热:毛细管溶液中有电流通过时,产生的热量; HPCE中的焦耳热与背景电解质的摩尔电导、浓度及电场强度成正比。 温度每变化1oC,将引起背景电解质溶液黏度变化2%3%;,5、添加剂的影响 (1)加入浓度较大的中性盐,如K2SO4,溶液离子强度增大,使溶液的黏度增大,电渗流减小。 (2)加入表面活性剂,可改变电渗流的大小和方向; 加入不同阳离子表面活性剂来控制电渗流。 加入阴离子表面活性剂,如十二烷基硫酸钠(SDS),可以使壁表面负电荷增加,zeta电势增大,电渗流增大; (3)加入有机溶
14、剂如甲醇、乙腈,使电渗流增大。,(四)淌度 (mobility) 淌度:带电离子在单位电场下的迁移速度; 淌度不同是电泳分离的基础。 1、绝对淌度(absolute mobility)ab 无限稀释溶液中带电离子在单位电场强度下的平均迁移速度,简称淌度。可在手册中查阅。 2、有效淌度(effective mobility)ef 实际溶液中的淌度(实验中测定的)。 ef=aii ai 溶质i 的解离度;i 溶质i 在解离状态下的绝对淌度 3、表观淌度 ap 离子在实际分离过程中的迁移速度(表观迁移速度): ap=ap E,(五)HPCE中的参数与关系式 1、迁移时间(保留时间) HPCE兼具有电
15、化学的特性和色谱分析的特性。有关色谱理论也适用。,V外加电压;L毛细管总长度 2、分离效率(塔板数) 在HPCE中,仅存在纵向扩散,2=2Dt,扩散系数小的溶质比扩散系数大的分离效率高,分离生物大分子的依据。,3、分离度,影响分离度的主要因素;工作电压V;毛细管有效长度与总长度比;有效淌度差。分离度可按谱图直接由下式计算。,(六)影响分离效率的因素区带展宽,1、纵向扩散的影响 在HPCE中,纵向扩散引起的峰展宽:2=2Dt 由扩散系数和迁移时间决定。大分子的扩散系数小,可获得更高的分离效率,大分子生物试样分离的依据。,2、进样的影响 当进样塞长度太大时,引起的峰展宽大于纵向扩散。分离效率明显下
16、降;理想情况下,进样塞长度: Winj= (24D t )1/2 实际操作时进样塞长度小于或等于毛细管总长度的1%2%。,3、焦耳热与温度梯度的影响 电泳过程产生的焦耳热可由下式计算:,m电解质溶液的摩尔电导;I工作电流:cb电解质浓度; 散热过程中,在毛细管内形成温度梯度(中心温度高),破坏了塞流,导致区带展宽。 改善方法: (1)减小毛细管内径; (2)控制散热;,4、溶质与管壁间的相互作用 存在吸附与疏水作用,造成谱带展宽; 蛋白质、多肽带电荷数多,有较多的疏水基,吸附问题特别严重,是目前分离分析该类物质的一大难题。 细内径毛细管柱,一方面有利于散热,另一方面比表面积大,又增加了溶质吸附
17、的机会。 减小吸附的方法和途径:加入两性离子代替强电解质,两性离子一端带正电,另一端带负电,带正电一端与管壁负电中心作用,浓度约为溶质的100-1000倍时,抑制对蛋白质吸附,又不增加溶液电导,对电渗流影响不大。,5、其他影响因素 (1)电分散作用对谱带展宽的影响 当溶质区带与缓冲溶液区带的电导不同时,也造成谱带展宽;尽量选择与试样淌度相匹配的背景电解质溶液。 (2)“层流”现象对谱带展宽的影响 一般情况下,HPCE中不存在层流,但当毛细管两端存在压力差时,出现抛物线形的层流; 产生的原因:毛细管两端液面高度不同。 实际操作时,保持毛细管两端缓冲溶液平面高度相同。,四、高效毛细管电泳分离模式
18、1、毛细管电泳分离模式: 区带毛细管电泳(capillary zone electrophoresis, CZE) 毛细管胶束电动色谱(micellar electrokinetic capillary chromatography, MEKC) 毛细管凝胶电泳(capillary gel electrophoresis, CGE) 毛细管等电聚焦(capillary isoelectric focusing , CIEF) 毛细管等速电泳(capillary isotachophoresis, CITP) 毛细管阵列电泳(capillary array electrophoresis, CA
19、E) 根据试样性质不同,采用不同的分离类型;每种机理的选择性不同,五、高效毛细管电泳应用 (一)应用 1、离子分析(analysis of ion),阳离子分析 迁移方向和电渗流方向一致; 4.5min内分离了24种金属离子; 阳极进样,阴极检测; 具有很高的灵敏度;,图 13 阳离子分离毛细管电泳图,阴离子分析 阴离子电泳方向和电渗流方向相反、速度接近,分析时间长、效率低; 质量小、电荷密度大的离子如:SO4-2、Cl-、F-等,电泳速率大于电渗流,阳极端流出,在阴极端无法检测;加入电渗流改性剂,十六烷基三甲基溴化胺等,使电泳方向和电渗流方向一致,可在3.1min内分离36种阴离子;阴极进样
20、,阳极检测; 离子价态及存在形态分析,图 14 阴离子毛细管分离图,2、药物分析,检测体液或细胞中某些代谢产物的分析; 尿液中的氨基酸含量作为临床诊断糖尿病的辅助手段; 采用毛细管区带电泳方式,在11min内分离17种药物,图 15 17种药物毛细管电泳分离图,采用MEKC(毛细管胶束电动色谱)模式,鉴定违禁药物;效果优于HPLC法,图 16 违禁药物毛细管胶束电动色谱分离图,3、手性化合物分析(analysis of chiral compounds) 合成获得单一手性化合物相当困难;528种手性合成药物,61中以单一对映体形式销售,其他为外消旋体;检测分析也相当困难;研究热点; R-反应式
21、是安眠药,S-式致胎儿畸形; HPCE分离分析手性化合物的方法:加入手性选择剂; 形成配合物的稳定常数有差异,结合HPCE的高效率; 常用手性选择剂:环糊精及其衍生物;手性冠醚;手性表面活性剂(氨基酸衍生物、胆酸钠、牛磺脱氧胆酸及其钠盐、低聚糖等天然手性表面活性剂) 4、氨基酸与蛋白质分析(analysis of amino acids) 采用MEKC模式,在25分钟内分离了23种丹酰化氨基酸; HPCE可取代传统的氨基酸分析仪; 问题:吸附和检测;,图 17 23种氨基酸的毛细管胶束电动色谱图,蛋白质分析,图 18 蛋白质混合物的毛细管等电聚焦分离图,5、核酸分析及DNA排序,图 19 CGE模式分离碱基对相差1000倍的DNA图谱,(二)新进展 1、微型化 整体化学分析系统(TAS)及TAS微型化 在硅片上光刻出矩形槽作为毛细管,理论塔板数105/m; 2、联用仪器 CE-MS; 3、阵列毛细管凝胶电泳 应用于人类基因DNA测序; 510万个基因,30亿个碱基对,目前最有效的DNA序列分析仪,10小时/次;可同时分析24个样品;速度1200碱基对/小时,提高速度! 100支毛细管阵列电泳;速度280碱基对/小时/支,
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