第五章分子生物学研究法上.ppt
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1、第五章 分子生物学基本研究法(上),DNA、RNA及蛋白质操作技术,现代分子生物学的快速发展,得益于上个世纪中叶以来研究方法、特别是基因操作和基因工程技术的进步。 基因操作主要包括DNA分子的切割与连接、杂交、电泳、细胞转化、核酸序列分析以及基因人工合成、表达、定点突变和PCR扩增等,是分子生物学研究的核心技术。,基因工程是指在体外将核酸分子插入病毒、质粒或其它载体分子,构成遗传物质的新组合,使之进入原先没有这类分子的寄主细胞内并进行持续稳定的繁殖和表达。 基因工程技术是核酸操作技术的一部分,只不过它强调了外源核酸分子在另一种不同的寄主细胞中的繁衍与性状表达。 事实上,这种跨越物种屏障、把来自
2、其它生物的基因置于新的寄主生物细胞之中的能力,是基因工程技术区别于其它技术的根本特征。,重组DNA技术发展史上的重大事件(三大成就): 一、在20世纪40年代确定了遗传信息的携带者(即基因的分子载体是DNA而不是蛋白质,解决了遗传的物质基础问题); 二、50年代提出了DNA分子的双螺旋结构模型和半保留复制机制,解决了基因的自我复制和世代交替问题; 三、50年代末至60年代,相继提出了“中心法则”和操纵子学说,成功地破译了遗传密码,阐明了遗传信息的流动与表达机制。,5.1 基因操作的基本工具 5.2 DNA操作技术 5.3 RNA基本操作技术 5.4 SNP的理论与应用 5.5 基因克隆(clo
3、ne)技术 5.6 蛋白质与蛋白质组学技术,(一)限制性核酸内切酶 能够识别DNA上的特定碱基序列并从这个位点切开DNA分子。 第一个核酸内切酶EcoRI是Boyer实验室在1972年发现的,它能特异性识别GAATTC序列,将双链DNA分子在这个位点切开并产生具有粘性末端(不是整齐地切开,即在两条链上的切开位点不对称)的小片段。,5.1 基因操作的基本工具,图5-1 几种主要DNA内切酶所识别的序列及其酶切位点,(二)基因克隆的载体 基因克隆即重组DNA技术,指在体外对DNA分子按照既定的目的和方案,采用酶学方法将不同来源的DNA分子在体外剪切和重新连接,组装成一个新的DNA分子。在此基础上,
4、将这个DNA分子导入到一定的宿主细胞,使它能够在宿主细胞中扩增,形成大量的子代分子,此过程即称为基因克隆.基因克隆包括四个基本技术环节: 目的基因和载体的获得; 目的基因与载体连接,形成重组分子; 重组DNA分子导入宿主细胞; 含有重组DNA分子的细胞的筛选和扩增; 基因克隆又称为DNA重组技术,DNA克隆或分子克隆。,基因克隆载体的三要素: 自我复制能力; 携带外源基因片段大小; 插入位点多少; 易于鉴定识别程度。,大肠杆菌质粒载体: 1、pSC101质粒载体 低拷贝数严紧型复制控制的大肠杆菌质粒载体,平均每个寄主细胞仅有12个拷贝。 长9.09kb,带有四环素抗性基因(tetr)及EcoR
5、I、HindIII、BamHI、SalI、XhoI、PvuII以及SmaI等7种限制性核酸内切酶的单酶切位点,在HindIII、BamHI和SalI等3个位点插入外源基因,会导致tetr失活。,大肠杆菌pSC101质粒载体示意图。,是第一个真核基因克隆载体。 缺点:它是一种严紧型复制控制(在寄主细胞内的复制除了受本身的复制机构的控制外,还受染色体的严紧控制,因此拷贝数较少,一般只有12个/每染色体。)的低拷贝质粒,从带有该质粒的寄主细胞中提取pSC101 DNA,产量很低。,2、ColE1质粒载体 松弛型复制控制的多拷贝质粒。 一般情况下,当培养基中氨基酸被耗尽,或是在细胞培养物中加入氯霉素以
6、抑制蛋白质的合成,寄主染色体DNA的复制便被抑制,细胞的生长也随之停止。 而松弛型质粒DNA却继续复制数小时,使每个寄主细胞中ColE1质粒的拷贝数达到10003000个,占细胞总DNA的50%左右。,3、穿梭质粒载体(shuttle plasmid vector) 指由人工构建的具有两种不同复制起点和选择记号,可在两种不同的寄主细胞中存活和复制的质粒载体。由于这类质粒载体可以保证外源DNA序列在不同物种的细胞之间得到扩增,能在原核和真核细胞之间往返穿梭,具有广泛的用途。,5. 2. 1 核酸的凝胶电泳 自从琼脂糖(agarose)和聚丙烯酰胺(polyacrylamide)凝胶被引入核酸研究
7、以来,按分子量大小分离DNA的凝胶电泳技术,已经发展成为一种分析鉴定重组DNA分子及蛋白质与核酸相互作用的重要实验手段。,5.2 DNA操作技术,一种分子被放置到电场中,它就会以一定的速度移向适当的电极。我们把这种电泳分子在电场作用下的迁移速度,叫做电泳的迁移率,它与电场强度和电泳分子本身所携带的净电荷数成正比,与片段大小成反比。,生理条件下,核酸分子中的磷酸基团呈离子化状态,所以,DNA和RNA又被称为多聚阴离子(polyanions),在电场中向正电极的方向迁移。 由于糖-磷酸骨架在结构上的重复性质,相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷,因此它们能以同样的速度向正电极方向迁移。,琼脂糖
8、凝胶分辨DNA片段的范围为0.250kb之间。 聚丙烯酰胺凝胶的分辨范围为1到1000个碱基对之间。 凝胶浓度的高低影响凝胶介质孔隙的大小,浓度越高,孔隙越小,其分辨能力就越强。,琼脂糖及聚丙烯酰胺凝胶分辨DNA片段的能力 凝胶类型及浓度 分离DNA的大小范围(bp) 0.3%琼脂糖 50 0001 000 0.7%琼脂糖 20 0001 000 1.4%琼脂糖 6 000300 4.0%聚丙烯酰胺 1 000100 10.0%聚丙烯酰胺 50025 20.0%聚丙烯酰胺 501,溴化乙锭染料的化学结构及其对DNA分子的插入作用。由于插入了溴化乙锭分子,在紫外光照射下,琼脂糖凝胶电泳中DNA的
9、条带便呈现出橘黄色荧光,易于鉴定。(溴化乙锭是高度灵敏的荧光染色剂,具有高致癌性! 普通浅黄色乳胶手套不能很好的阻挡,最好用蓝色实验用手套。),DNA脉冲电场凝胶电泳(PFGE pulsed-field gel electrophoresis) 示意图,在脉冲电场中,DNA分子的迁移方向随着电场方向的周期性变化而不断改变。在标准的PFGE中,第一个脉冲的电场方向在另一侧成45夹角。由于琼脂糖凝胶的电场方向、电流大小及作用时间都在交替变化,使得DNA分子能够随时调整其游动方向,以适应凝胶孔隙的无规则变化。,5. 2. 2 细菌转化与目标DNA分子的增殖 通过细菌转化方法将体外构建好的杂种DNA分
10、子导入宿主细胞中。外源DNA通过自身载体上的复制起始点进行复制增殖,能在宿主细胞中长期保存下来,并能以完整的形式从细胞中被分离纯化出来。,细菌转化(transformation),是指一种细菌菌株由于捕获了来自供体菌株的DNA而导致性状特征发生遗传改变的过程。提供转化DNA的菌株叫作供体菌株,接受转化DNA的细菌菌株则被称为受体菌株。,细菌转化及蓝白斑筛选,为提高效率,可对受体菌进行物理或化学处理,增加其获取DNA的能力。经过这种处理的细胞被称作感受态细胞(competent cells)。,蓝白斑筛选原理图,两种增强转化的处理方法: CaCl2法 将快速生长期大肠杆菌置于经0预处理的低渗Ca
11、Cl2溶液中,细胞膨胀,膜通透性改变,易与外源DNA相粘附。 将该体系转移到42下做短暂的热刺激,外源DNA就可能被细胞吸收。将经过转化后的细胞置于选择性培养基上,筛选阳性克隆。 转化效率可达到51062107个转化子/g超螺旋质粒DNA(转化后的受体菌称为转化子transformant )。, 电击法 电脉冲(电场强度、方向或电流的周期性变化)可以在细胞膜上造成小凹陷,形成疏水孔洞。随着跨膜电压增加,大疏水性孔洞会转变为亲水性孔洞,介质中的DNA易于进入细胞质。 电脉冲处理的具体方法:将生长至对数中期的E. coli菌液冷却至4后离心,洗菌后用10%的甘油悬浮,将高密度菌液(21010/ml
12、)置于特制的电极杯中进行电击。,获得最大转化效率时场强一般为12.515kV/cm,时间跨度一般为4.55.5毫秒。 电击转化与温度有关,一般在04进行。由于转化载体上常带有LacZ基因(大肠杆菌乳糖操纵子中的一个基因),多用带有不同抗生素(常用的抗生素包括氨苄青霉素、卡那霉素和四环素等)的选择性培养基结合蓝白斑筛选法鉴定转化细胞。,5. 2. 3聚合酶链式反应(PCR)技术 聚合酶链式反应是快速扩增DNA序列最常用的方法。 PCR反应的模板DNA若是基因组上的某个片段,就称为genomic PCR,若是mRNA反转录产生的cDNA,就称为RT-PCR。,PCR技术的原理: 首先将双链DNA分
13、子在临近沸点的温度下加热分离成两条单链DNA分子,DNA聚合酶以单链DNA为模板并利用反应混合物中的四种脱氧核苷三磷酸合成新生的DNA互补链。,步骤(三步): DNA解链(变性) 引物与模板DNA相结合(退火) DNA合成(链的延伸) 经不断重复循环之后,反应混合物中所含有的双链DNA分子数(两条引物结合位点之间的DNA区段的拷贝数),理论上的最高值应是2n, 实得1.8n(n:循环次数)。,聚合酶链式反应(PCR)技术,PCR指数扩增时循环次数与DNA产物数量的比较,DNA解链(PCR的第一步):高温处理 将含有待扩增DNA样品的反应混合物放置在高温(94)环境下加热1分钟,使双链DNA变性
14、,形成单链模板DNA。,94加热,淬火,引物与模板DNA相结合(第二步):退火 降低反应温度(退火,约50),约1分钟,使寡核苷酸引物与两条单链模板DNA结合在靶DNA区段两端的互补序列位置上。,5060,退火 引物与模板DNA相结合,DNA合成(第三步): 将反应混合物的温度上升到72左右保温1-数分钟,在DNA聚合酶的作用下,从引物的3-端加入脱氧核苷三磷酸,并沿着模板分子按53方向延伸,合成新生DNA互补链。,PCR扩增,72左右, 按每 分钟1000个碱基对设计,循环往复,常规PCR技术能扩增两引物之间的DNA区段,然而,有时我们也希望扩增位于靶DNA区段之外的未知DNA序列,这就需要
15、应用反向PCR(reverse PCR)技术。,先用一种在靶DNA区段上没有识别位点的核酸限制内切酶,从距靶DNA区段有一定距离的两侧位置切割DNA分子,然后将这些片段作分子内连接成环形。根据已知的靶DNA序列按向外延伸的要求设计一对向外引物,保证被扩增的是位于靶DNA区段两侧的未知DNA序列。,反向PCR的基本操作程序。波纹线表示靶DNA区段,箭头表示限制性内切酶位点,分别用方框表示靶DNA区段的左侧和右侧序列。,用一种在靶序列上没有酶切位点的核酸限制性内切酶消化DNA; 产生大小不同的线性DNA片段群体,其中靶DNA区段的DNA分子长度不超过23kb,经连接后重新环化; 按靶序列设计的一对
16、引物与互补序列退火结合,其延伸方向如箭头所指;,经PCR扩增产生的主要是线性双链DNA分子,它是由左侧序列和右侧序列首尾连接而成,其接点是所用限制性内切酶的识别位点。,5. 2. 4 实时定量PCR (real time quantitative PCR,Q-PCR) 由于PCR敏感性高(在几个小时内将特异的一段DNA序列扩增到数百万倍以上 ),扩增产物总量变异系数大,定量不准确。90年代末期出现了Q-PCR,利用荧光检测PCR仪绘制DNA扩增过程中的累积速率动态变化图,基本消除在测定终端产物丰度时变异系数较大的问题。,混合在PCR反应液中的荧光探针只有与大片段DNA结合后,才能够被激发出荧光
17、。 随着新合成DNA片段的增加,由于结合到DNA上的荧光探针增加,被激发产生的荧光相应增加。 非序列特异性荧光染料SYBR Green I , 激发光波长520nm。,SYBR Green I作探针的实时定量PCR实验过程示意图(荧光强度反映PCR产物的量),Han P., Li Q., and Zhu Y.X. (2008) The Plant Cell 20:1482-1493.,(野生型拟南芥),(野生型拟南芥的突变体),P169,为确保荧光检测的确实是靶DNA,又设计了仅能与目的DNA特异结合的荧光探针。 TaqMan探针是一段与靶DNA序列中间部位结合的单链DNA,长50bp-150
18、bp,该DNA的5和3端带有短波长和长波长两个不同荧光基团,由于彼此距离靠近,在荧光共振能量转移(FRET)作用下发生荧光淬灭,因而检测不到荧光。,随着PCR反应的进行,TaqMan 探针结合到目的DNA序列上,并且会被具有外切酶活性的Taq DNA聚合酶逐个切除而降解。切下来的荧光基团解除了荧光淬灭的束缚,会在激发光下发出荧光,因此,产生的荧光强度直接反映了所扩增靶DNA的总量。,TaqMan探针实时定量PCR技术,TaqMan探针具有三个要素。(见P168) 在此状态下两个荧光基团十分接近,不发荧光。,Ct值是产物荧光强度首次超过设定阈值时,PCR反应所需的循环数。利用标准曲线,可以确定样
19、品中待检测靶DNA的绝对含量。,用实时定量PCR法分析未知样品靶基因的绝对表达量。(P169),5. 2. 5 基因组DNA文库构建 把某种生物的基因组DNA切成适当大小,分别与载体组合,导入微生物细胞,形成克隆。汇集包含基因组中所有DNA序列的克隆(理论上每个序列至少有一个代表),这样的克隆片段的总汇,称为基因组DNA文库。,Clark和Carbon于1975年提出公式: N=ln(1-p) / ln(1-f) 式中:N表示一个基因组文库所应该包含的重组克隆数目;p表示所期望的靶基因在文库中出现的概率;f表示重组克隆平均插入片段的长度与基因组DNA总长的比值。 为获得整个基因簇或一个基因及其
20、两翼延伸序列,基因组文库中的DNA片段常大于20kb。以人为例,其基因组大小为3109bp若p=99%,平均插入片段大小为20kb,则N=6.9105。,构建基因组文库最常用的是噬菌体载体(克隆能力约1520kb)和限制性内切酶部分消化法。例如用识别4个核苷酸的核酸限制性内切酶Sau3A,与BamHI是一对同尾酶消化DNA,由Sau3A酶切产生的DNA片段可插入到经BamHI消化的噬菌体载体上。,用Sau3A限制性核酸内切酶消化真核生物基因组DNA并利用噬菌体载体构建基因组文库的过程图示。,噬菌体作为克隆载体,此外,还有很多大容量克隆载体,如柯斯质粒、细菌人工染色体(BAC)、P1源人工染色体
21、(PAC)、酵母人工染色体(YAC)等都可用于基因组文库的构建。 它们的优点是可以插入更大片段DNA,但是稳定性一般较差,在大量复制的过程中容易出现缺失现象。操作也相对较困难。,5. 3 RNA基本操作技术,真核生物基因组DNA庞大,有大量重复序列,很难直接分离得到靶基因片段。而cDNA来自反转录的mRNA,无冗余序列,通过筛选cDNA文库,可较快地分离到相关基因。,细胞中的总RNA包括mRNA,rRNA ,tRNA以及一些小RNA(sRNA)。 一个典型的动物细胞约含10-5g RNA,其中: 80%-85%为rRNA 15%-20%为tRNA及sRNA mRNA约占总RNA 的1%-5%,
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