第十二章遗传工程.ppt
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1、,第十二章 遗传工程,第一节 遗传工程概述 遗传工程广义:细胞工程、染色体工程 细胞器工程、基因工程 酶工程、发酵工程 狭义:基因工程 基因工程概述 基因工程是20世纪70年代初随着DNA重组技术的发展应运而生的一门新技术。,1982年经美国食品及药物管理局批准 ,采用基因工程方法在细菌中表达生 产的人的胰岛素进入市场,成为基因 工程产品直接造福于人类的首例 1985年转基因植物获得成功 1996年克隆羊诞生。 现在,人类已利用这一技术改造和创 建新的生命形态、生产药品、疫苗、 牛奶和食品,诊断和治疗遗传疾病。,基因工程的基本步骤: 1.目的基因的分离或合成 2.将目的基因与载体DNA连接,构
2、建重组DNA分 子-表达载体 3.将重组DNA分子导入受体细胞,并获得具有外 源基因的个体 4.转基因生物的检测与鉴定 5.转基因生物的安全性评价,第二节 基因的分离 基因分离(克隆)包括3个步骤: 1. 目标DNA片段(基因)的分离 2. 目标基因克隆到载体上 3. 载体导入宿主细胞并在其中大量 复制,一、工具酶 1、限制性内切核酸酶 限制酶:作用于特定(异)核苷酸序列 的磷酸二脂酶 型酶:仅EcoB和EcoK两种,催化限制 性切割和修饰核苷酸2种功能 型酶:遗传工程中应用最广泛 型酶:具有特异的识别位点,识别位 点是非对称的,型限制性酶的基本特性: 有特异识别和切割的序列部位 DNA分子上
3、两个单链断裂的部位通 常不是直接相对的 断裂所形成的DNA片段常具有碱基 互补的单链尾巴(粘性末端) 内切酶的切割和修饰功能由两个 不同的酶催化所完成,即内切酶 活性和甲基化作用活性是分开的,限制性内切酶EcoRI的酶切位点及酶切产物连接,回纹序列,图12-1通过用相同的限制性内切酶切割 形成一个重组DNA分子,限制性内切酶SmaI的识别及酶切位点,平齐末端,2、DNA连接酶 DNA连接酶是重组DNA分子构建必不可少的工具酶,能催化DNA中相邻的3 OH和5 磷酸基末端之间形成磷酸二酯键并把两段DNA连接起来,3、反转录酶 反转录酶是一类以RNA为模板来指导DNA合成的DNA聚合酶,故又称依赖
4、于RNA的DNA聚合酶 通常用反转录酶构建cDNA文库(cDNA library),4、聚合酶链式反应(PCR) PCR是体外快速扩增DNA的方法,由美国的Mullis(1986)发明, 1993年诺贝尔化学奖 PCR可对特定DNA片段进行扩增,且可用痕量DNA作模板,对DNA纯度要求也不高,可在几小时内使目的基因片段扩增到数百万个拷贝 PCR反应在一种混合液中进行,该混合液包括四种主要成分:两个引物(一般为20 bp)、模板DNA、热稳定的DNA聚合酶(Taq酶,在95甚至更高的温度下活性稳定)和四种脱氧核苷酸。PCR反应在PCR仪上自动进行,PCR反应从启动到结束称为一个循环,每个循环包括
5、三个步骤: 1)变性:95,DNA 双链分离成单链 2)退火(复性):55 左右,引物与单链的 模板DNA序列互补结合 3)延伸:72左右, Taq酶通过在引物 的3-OH端增加碱基的 办法使引物延伸,表12-2 PCR循环数与PCR产物的拷贝数之间的关系,二、载体 1、重组DNA技术 重组DNA:指利用不同生物来源的DNA分子拼接的杂种DNA 分子,是自然界中不存在的DNA分子 重组DNA技术是基因克隆的关键技术,其主要步骤为: 1) 从细胞或组织获得DNA并纯化 2) 用限制酶切割DNA 3) 将获得的限制片段连接到载体上,形成重组DNA分子 4) 重组DNA导入宿主细胞,在宿主细胞内复制
6、,产生大 量相同拷贝的重组DNA分子-克隆 5) 克隆的DNA分子可以从宿主细胞中回收,纯化 6) 克隆的DNA可以转录和翻译,其产品可以被分离出来 用于研究或商业开发。,图 12-5 重组DNA技术流程,2、载体 载体:将外源基因送入受体细胞的工具 载体类型:细菌质粒、噬菌体或病毒、细菌/酵母菌人工染色体BAC、YAC等 载体特点: 在宿主细胞中能独立复制,即本身为复制子 ,有独立的复制起始位点 有限制酶切位点,允许外源基因插入且插入 后随载体DNA分子一同进行复制或扩增 有选择标记,便于选择含重组DNA分子的寄主 细胞 分子量小,多拷贝,易于操作 具有安全性等,(1)细菌质粒:广泛应用于基
7、因工程,图12-6 质粒PUC18的结构及多克隆位点,Ti质粒及其衍生载体 Ti质粒包括五个区域,1. LB与RB之间的T-DNA,这段序列整合到植物基因组中; 2. 质粒转移区(PT); 3. 冠瘿碱代谢区; 4. 复制原点; 5. 毒性区。,T-DNA区域内的所有基因与转移无关,所以将致瘤基因全部缺失即卸甲(disarmed)后,将细菌抗生素的抗性基因或其它序列插入到这个区域,形成的T-DNA仍可将RB至LB内的序列转移并整合到植物基因组。 Vir区的毒性基因是T-DNA转移所必需的,毒性基因可以顺式及反式两种方式控制T-DNA转移。,Ti质粒是约150-200kb的环状DNA分子,很难直
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