第十章外源基因表达与基因工程药物.ppt
《第十章外源基因表达与基因工程药物.ppt》由会员分享,可在线阅读,更多相关《第十章外源基因表达与基因工程药物.ppt(120页珍藏版)》请在三一文库上搜索。
1、第十章外源基因表达与基因工程药物,第一节 概 述,外源基因的表达:利用细胞内相关酶系及其调控系统,将外源基因转录成肽链或加工成活性蛋白质的过程。 具体的说,利用分子生物学技术,在体外将编码外源蛋白质的基因重组至适宜的表达载体上,通过相关技术将其导入宿主细胞内,借助宿主细胞的转录、翻译或翻译后修饰酶系及相应的调控系统,在宿主细胞合成或分泌具有原有生物活性的蛋白质。,目的:针对难以或无法从自然界直接提取、分离、纯化所获得的,或制造成本、产量规模等受限制的,或利用化学方法无法合成的多肽,蛋白质、酶这类生物分子药物,利用细胞或组织或器官或生命体的复制、转录、翻译及其调控系统以及翻译后加工、修饰等体系,
2、按人的意愿生物合成这些生物分子,并从中将表达产物分离纯化至预期程度,最终加工成药品。,基因工程概念,基因工程(genetic engineering)是指采用人工方法将不同来源的DNA进行重组,并将重组后的DNA引入宿主细胞中进行增殖或表达的过程,从而改变生物特性或创造新的生物类型的技术,基因工程的发展史,一、基因表达基本原理,基因表达(gene expression)是指储存遗传信息的基因在各种调节机制下经过一系列步骤表现出其生物功能的整个过程。典型的基因表达是基因经过转录和翻译,产生有生物活性的蛋白质过程。,基因工程技术的核心是基因表达技术。,基因重组的主要目的是要使目的基因在某一细胞中能
3、得到高效表达。,基因表达在原核生物与真核生物中的差别,原核生物与真核生物肽链合成过程的主要差别,蛋白质合成的特点,1.真核生物的蛋白质合成与mRNA的转录分开进行 原核生物的蛋白质合成与mRNA的转录偶联在一起同时进行 2.真核生物中的mRNA为单顺反子 原核生物中的mRNA为多顺反子 3.真核生物合成体系中的RNA和蛋白质在结构上与原核生物不同,且其线粒体有独立的蛋白质生物合成体系,阻遏蛋白介导的负调控和cAMP-CAP介导的正调控共同担负着原核生物体内糖源的协调利用 翻译水平的调控是对原核生物转录水平的补充 1.转录与翻译的偶联提高了基因表达调控的有效性 2.SD序列影响翻译起始速率 3.
4、翻译阻遏利用蛋白与自身mRNA的结合实现翻译起始的调控 4.mRNA密码子的编码频率影响翻译的延伸速度,基因表达调控的影响因素,原核生物,(一)真核生物染色质结构影响基因转录 1.转录活化的染色质对核酸酶极为敏感 2.转录活化的染色质的组蛋白发生改变 3.RNA聚合酶结合位点的上游和下游具有不同的超螺旋构象 4.CpG岛甲基化水平降低 (二)顺式作用原件(启动子、增强子和沉默子)直接影响基因表达活性 (三)转录因子的调控 (四)真核生物在转录后仍可控制mRNA的结构和功能,其在转录后层次不同于原核生物,基因表达调控的影响因素,真核生物,二、基因表达基本类型,第二节外源基因表达基本过程,将外源基
5、因通过体外重组后导入受体细胞,使该基因能在受体细胞内复制、转录、翻译和表达 【四个要素】 工具酶、载体、基因和受体(宿主)细胞,基因工程的基本过程,目的基因的获取:从生物体中分离或人工合成 重组载体的构建:对目的基因和载体DNA进行剪切、修饰,在连接酶的作用下连接形成完整有复制能力的重组体 重组DNA分子导入合适的受体细胞:重组DNA分子引入受体细胞中进行扩增,基因工程的基本过程,重组体的筛选与鉴定:直接筛选法(如抗药标志选择)和免疫学方法 目的基因的表达及分离纯化:原核与真核表达,一、目的基因的获得,外源基因表达的第一步是获得目的基因 获得目的基因的主要方法包括: 化学合成 RT-PCR从含
6、有目的基因的总RNA或mRNA中扩增 从cDNA文库或基因组文库中PCR扩增 通过杂交技术筛选 利用合适的筛淘技术从各种文库中筛选,聚合酶链式反应(PCR),PCR(polymerase chain reaction): 在体外由引物介导的、酶促快速合成扩增特定基因或DNA片段的一种方法。,原理 在适当缓冲液(Mg2+)反应体系中,根据碱基配对原理利用DNA聚合酶催化和dNTPs的参与下,引物依赖于DNA模板特性指导DNA合成,基本步骤,变性:双链DNA解离成为单链(90以上) 退火(复性):引物与模板DNA单链的互补序列配对结合(50 左右) 延伸:DNA模板-引物结合物在TaqDNA聚合酶
7、的作用下,以dNTP为反应原料,靶序列为模板,按碱基配对原则,合成一条新的互补链 (70 左右),PCR反应五要素,引物、酶、dNTP、模板和Mg2+ PCR反应的特异性决定因素: 引物与模板DNA特异正确的结合 碱基配对原则 Taq DNA聚合酶合成反应的忠实性 靶基因的特异性与保守性,PCR的应用,研究基因克隆;DNA测序;分析突变 诊断细菌、病毒、寄生虫检测及诊断 人类基因组工程遗传图谱的构建;DNA测序;表达图谱 法医犯罪现场标本分析 肿瘤各种肿瘤检测 其他,二、目的基因与表达载体的重组,重组载体的构建:对目的基因和载体DNA进行剪切、修饰,在连接酶的作用下连接形成完整有复制能力的重组
8、体。,(一)载体,对于外源基因的表达,第二个问题就是选择合适的表达载体并将目的基因重组至表达载体上。 表达载体主要包括:质粒载体、噬菌体或病毒载体。 表达载体是目的基因在宿主细胞中遗传、转录、翻译以及可能的翻译后修饰加工的保障。,基因工程载体的基本条件,能在宿主细胞中复制繁殖 容易进入宿主细胞 有合适的限制性核酸内切酶位点,容易插入外来核酸片段,插入后不影响其进入宿主细胞和在细胞中的复制 有容易被识别筛选的标志 容易从宿主细胞中分离纯化出来,基因工程载体分类,根据载体的分子生物学特性划分 质粒型载体环状dsDNA分子,自主复制 病毒型载体环状、线状、ss-和ds-DNA分子,形成病毒颗粒 混合
9、型载体具质粒和病毒特性,特性的转换依赖于宿主细胞生物学特性,根据载体功能划分: 克隆载体质粒、噬菌体、粘性质粒、M13噬菌体 表达载体大肠杆菌表达载体、哺乳动物细胞表达载体,常用载体,质粒(plasmid) 独立于细菌染色体以外的遗传物质,能够自我复制的双链闭合环状DNA分子,质粒的特点,大多数质粒DNA是是环状双链的DNA分子 复制类型分为严紧型和松弛型 有共价闭合环形、开环和线性三种构型 泳动速度:SCDNA LDNA OCDNA 质粒具有不相容性 具有转移现象和迁移作用,pBR322质粒,分子量较小。 两种抗菌素抗性基因 较高的拷贝数,且经氯霉素扩增之后,每个细胞中可累积10003000
10、个拷贝 对多种常见的限制性内切核酸酶只含有一个能切割的位点,pUC质粒,多克隆位点; 松弛复制; 氨苄青酶素抗性; 可通过化学显色筛选, 噬菌体载体,特点 双链DNA分子(线性或环形) 两端具有12个nt单链互补粘性末端 具非必需区(中间区约1/3长度) 可在E.Coli中大量繁殖 可克隆15Kb左右的外源基因,载体类型 (两种) 插入型载体:外源DNA克隆到分子上,使噬菌体的某种生物功能丧失效力,即插入失活效应 取代型载体(替换型载体):提高了克隆外源DNA的能力,M13噬菌体(M13 phage),只感染有F性菌毛的大肠杆菌噬菌体 基因组DNA全长6.5kb(单链) 感染后,可复制成双链D
11、NA(RF,DNA) RF只有(+)链复制,相当于质粒载体,M13噬菌体载体,优点: 既可以提供单链DNA,也可以提供双链的DNA。 缺点:插入大的DNA片段后表现不稳定,在噬菌体增殖过程中容易发生缺失。所以一般克隆的片段在1kb之内,克隆300-400bp的片段十分稳定。,粘尾质粒(cosmid),由DNA的两端粘性末端区域(COS区)与质粒构建的环状双链DNA 特点: 含质粒的抗性标记如Amp,Tet 带COS区,可进行体外包装 一个或多个酶切位点 加入特异性启动子利于双向转录 分子量小,容量大 /筛选AP平板 粘性DNA质粒接上能在真核细胞生活的元件则能在真核中转染及筛选,大容量载体,细
12、菌人工染色体(BACs): E.coli F质粒,供体DNA300kb,用于大基因组分析 P1人工染色体(PACs):噬菌体P1,需要体外包装盒转导,供体DNA约100kb,用于大基因组分析 酵母人工染色体(YACs):酿酒酵母着丝粒、端粒和自主复制序列,供体DNA2000kb,用于大基因组分析和YAC转基因动物,质粒的构建策略,质粒载体必需的三个部分 复制区:含有复制起点; 选择标记:抗性基因; 克隆位点:便于外源DNA的插入,质粒的构建策略,缩短载体长度,扩充载体容纳能力 合理增加酶切位点数目,形成多克隆位点 引入多用途辅助序列,提供质粒新特 设计具有特殊选择标记,最好是能够赋予宿主易于检
13、测的表型,穿梭载体(shuttle vector),能在两种不同的生物中复制的载体,具有细菌质粒的复制原点及选择标记基因 有真核生物的自主复制序列(ARS)以及选择标记性状 具有多克隆位点 在细菌中用于扩增克隆的基因 在真核生物中用于基因表达分析,穿梭载体(shuttle vector),表达载体 (Expression vectors),真核细胞载体,哺乳动物细胞的病毒载体 含有原核基因序列即:复制子和抗性基因 含有哺乳动物细胞启动子和增强元件使外源基因有效转录 转录终止信号和poly(A)信号 含有可选择的剪切信号 含有一个以上的限制性酶切位点,真核细胞载体,酵母载体 组成遗传标记;调控序
14、列(ARS、环状质粒DNA、启动子);由质粒DNA与酵母DNA重组的穿梭质粒 杆状病毒载体昆虫细胞多角病毒载体 具有蛋白修饰、加工和转运体系 产物可溶性表达 适于克隆大片外源DNA 不侵染脊椎动物,(二)重组,体外重组技术的建立是建立在一系列可以在体外应用的DNA限制性内切酶和DNA连接酶,以及PCR技术的推广。 目的基因和载体DNA分子的体外重组关键在于:选择合适的重组位点、剪切位点;以及剪切后适当的条件将目的基因和载体DNA分子连接获得重组分子。,基因工程相关酶学,限制性核酸内切酶,具有识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列,并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶,型:修饰酶活性和依赖于A
15、TP的限制性内切酶活性 型:内切酶活性和修饰酶活性,专一性强。既具有切割位点的专一性, 也具有识别位点的专一性, 一般在识别序列内切割 型:作用方式同型,命名方式,型限制性核酸内切酶,基本特性 识别ds-DNA中含-8个相连的碱基对组成的特定回文序列 断裂后形成的DNA片段具有互补碱基的单链延伸末端(粘性末端)或平末端,5 C T G C A G 3 3 G A C G T C 5,5 G G A T C C 3 3 C C T A G G 5,5 G A T C 3 3 C T A G 5,5 G G C C 3 3 C C G G 5,Hae,Mbo,BamH,Pst,II型限制性内切核酸
16、酶,几种II型限制性核酸内切酶的 酶切位点,同裂酶(isoschizomer)来源不同, 识别和切割位点相同 同尾酶(isoaudamers)来源、识别序列和切割方式均不相同,但产生的限制性片段却是相同的粘性末端,限制性内切酶对DNA的消化作用及其片段化 消化作用以同型二聚体形式与靶DNA序列作用,所识别的靶序列大小决定着DNA片段的大小 片段化:单酶切、双酶切、一部分酶切 具有粘性末端DNA片段的连接 不同的DNA片段通过互补的粘性末端配对连接分子间连接 同一片段的两个互补末端之间碱基配对形成环形分子内连接,载体与目的片段连接,影响限制性内切酶活性的因素 DNA的纯度 DNA甲基化程度 底物
17、DNA的分子构型 反应温度 反应系统组成 酶量、反应体积、酶切时间,限制酶的用途 DNA重组与构建新基因组文库 组建DNA物理图谱 DNA 分子杂交 制备DNA放射性探针 DNA序列分析,DNA连接酶,封闭DNA链上缺口酶,借助能量催化DNA链的5-PO4与另一DNA链的3-OH生成磷酸二酯键。用于DNA重组和质粒的构建,大肠杆菌DNA连接酶:只能连接具粘性末端DNA分子,以NAD作辅助因子 T4 DNA连接酶:连接粘性末端,高浓度可连接平末端,要求3-OH和5-PO4 。催化过程需要ATP和Mg,聚合酶,以DNA(RNA)为模板,催化DNA(RNA)的体外合成,特点: 以脱氧核苷酸三磷酸(d
18、NTP)为前体催化合成DNA 需要模板和引物的存在 不能起始合成新的DNA链 催化dNTP加到生长中的DNA链的3-OH末端 催化DNA合成的方向是53,聚合酶的分类及特点,大肠杆菌DNA聚合酶: 53的聚合作用 3 5 的外切酶活性 53外切酶活性 Klenow 聚合酶: 53聚合酶活性 3 5 外切酶活性 没有53外切酶活性 用于填补DNA单链末端成为双链,聚合酶的分类及特点,T4-DNA聚合酶 :无53外切酶活性 、需要一条有引物的单链DNA作模板 、 3 5 外切酶活性 Taq DNA 聚合酶: 53聚合酶活性 53外切酶活性,有链置换合成能力 不具有3 5 外切酶活性,没有校正功能
19、良好的热稳定性 用于DNA序列分析和PCR反应,逆转录酶(reversetranscriptase),两类:禽类成骨细胞性白血病病毒逆转录酶(AMV) moloney小鼠白血病病毒逆转录酶(MMLV) 作用: 以RNA为模板合成DNA,构建cDNA文库 RT-PCR 制备杂交探针,以RNA为模板合成DNA的酶( RNA指导的DNA聚合酶),碱性磷酸酶(alkaline phosphatase): 去除DNA /RNA 5-P,制备载体时可防止载体自身连接, 提高重组效率 末端脱氧核苷酰转移酶: 在DNA的3-OH上,加上 dNTP,DNA和RNA的修饰酶,载体DNA与目的基因的连接,粘性末端连
- 配套讲稿:
如PPT文件的首页显示word图标,表示该PPT已包含配套word讲稿。双击word图标可打开word文档。
- 特殊限制:
部分文档作品中含有的国旗、国徽等图片,仅作为作品整体效果示例展示,禁止商用。设计者仅对作品中独创性部分享有著作权。
- 关 键 词:
- 第十 章外源 基因 表达 基因工程 药物
链接地址:https://www.31doc.com/p-2970347.html