第四章比色分析与分光光度分析.ppt
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1、2019/6/15,1,发酵工业分析,第四章 比色分析与分光光度分析,2019/6/15,2,比色法的发展,比色法(colorimetry)是通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法. (1)早在公元初古希腊人就曾用五倍子溶液测定醋中的铁。 (2)1795年,俄国人也用五倍子的酒精溶液测定矿泉水中的铁。 (3)比色法作为一种定量分析的方法,大约开始于19世纪3040年代。 (4)20 世纪3060年代,是比色法发展的旺盛时期,此后就逐渐为分光光度法所代替。,2019/6/15,3,第一节 概 述,1 光度分析法的特点 2 物质对光的选择性吸收 3 光吸收的基本定律 4 常用仪
2、器 5 显色反应及显色条件的选择 6 影响比色与分光光度分析的因素,2019/6/15,4,1 光度分析法的特点,有色物质颜色的深浅和浓度有关,利用比较溶液颜色深浅来测定含量的分析方法称为比色分析法。 目视比色称为比色法;利用分光光度计测试,称为分光光度法。 光度分析法特点: (1) 具有较高的灵敏度。 一般物质可测到10-310-6 molL-1 (2) 有一定的准确度。 相对误差为2%5% (3) 操作简便、快速,选择性好,仪器设备简单。 (4) 应用广泛。,2019/6/15,5,2 物质对光的选择性吸收,在可见光区(400760nm)不同波长的光具有不同的颜色。 溶液呈现一定的颜色是对
3、光选择性吸收的结果。当一束白光通过一有色溶液时,某些波长的光被溶液吸收,另一些波长的光则透过,溶液的颜色由透过光决定。 透射光与吸收光又可组成白光,这两种光称为互补色光。,2019/6/15,6,如CuSO4溶液呈蓝色就是吸收了白光中黄光。,2019/6/15,7,如果将不同波长的光通过一固定浓度和厚度的有色溶液,测量每一波长下有色溶液对光的吸收程度(吸光度A),然后以波长为横坐标,吸光度为纵坐标作图,得一曲线,称吸收曲线。,2019/6/15,8,图中、三条曲线,代表同一被测物质含量由高到低的吸收曲线。,邻二氮杂菲亚铁溶液的吸收曲线,2019/6/15,9,(1)同一种物质对不同波长光的吸光
4、度不同。吸光度最大处对应的波长称为最大吸收波长max (2)不同浓度的同一种物质,其吸收曲线形状相似,max不变。而对于不同物质,它们的吸收曲线形状和max则不同。 (3)在max处吸光度随浓度变化的幅度最大,所以测定最灵敏。吸收曲线是定量分析中选择入射光波长的重要依据。,2019/6/15,10,3 光吸收的基本吸收定律,(1) 朗伯-比尔定律 (2) 吸光度的加和性 (3) 对朗伯-比尔定律的偏离,2019/6/15,11,(1) 朗伯-比尔定律,当一束平行的单色光通过均匀、透明的有色溶液时,如溶液的浓度越大、液层厚度越大,则光强度的减弱越显著 。,I0:入射光强度;It:透射光强度,“A
5、” 称为吸光度,量纲为1 。 溶液对光的吸收程度越大,则透射光强度越小 ,A越大。,2019/6/15,12,吸光度测量中,也用透光度T表示,透过光强度越大, T值越大。,2019/6/15,13,b:液层的厚度 cm; c:溶液的浓度 gL-1 K:吸光系数 L g-1 cm-1 如“c”的单位:molL-1,此时的吸光系数称为摩尔吸光系数 k,k:摩尔吸光系数 L mol-1 cm-1,式中M为摩尔质量,2019/6/15,14,k 是吸光物质在一定波长和溶剂条件下的特征常数。 在温度和波长等条件一定时, k 仅与吸收物质本身的性质有关,与待测物浓度无关。 k 是吸光物质吸光能力的量度,
6、k 值越大, 光度法测定该物质的灵敏度越高。 由实验结果计算时,常以被测物质的总浓度代替吸光物质的浓度,这样计算的 k 值实际上是表观摩尔吸光系数。,2019/6/15,15,例:已知含Fe2+浓度为1.0mgL-1的溶液,用邻二氮菲光度法测定铁(Fe2+与邻二氮菲反应,生成橙红色配合物)。使用厚度为2 cm的吸收池,在波长510nm处测得 吸光度A= 0.390。计算该配合物的 摩尔吸光系数。 解:已知铁的相对原子质量为 55.85。,2019/6/15,16,(2) 吸光度的加和性,在含有多组分的体系中,若各组分对同一波长的光都有吸光作用,且各组分的吸光物质彼此不发生作用,则测得的吸光度等
7、于各组分的吸光度之和。 A = A1+A2+A3,2019/6/15,17,(3) 对朗伯-比尔定律的偏离,比尔定律的局限性 非单色入射光引起的偏离 由于溶液本身发生化学变化的原因引起的偏离,2019/6/15,18,比尔定律的局限性,通常在用分光光度法进行分析时,多采用标准工作曲线法。即固定液层厚度、入射光的波长,测定一系列不同浓度标准溶液的吸光度,此时A与c应成直线关系。,在实际工作上,特别是在浓度较高时,常出现标准曲线不为直线,即偏离了朗伯比尔定律。,2019/6/15,19,比尔定律是一个有限制性的定律,它假设入射光为单色光,吸收粒子间没有干扰。因此仅在稀溶液中才适用。在高浓度时,由于
8、吸光物质微粒间相互影响,从而改变了它对光的吸收能力,使吸光度与浓度的线性关系发生偏离。,2019/6/15,20,非单色光引起的偏离,比尔定律假设入射光为单色光,但是目前仪器所能提供的入射光不是严格的单色光,是由波长范围较窄的光带组成的复合光。 A = k b c,k 在一定波长下是一常数,如入射光不为单色光,则k不为常数,A 与c 不成直线关系。,2019/6/15,21,在最大吸收波长附近通常有一个吸收强度相差较小的区域,如入射光在此范围内,因k 变化较小,引起的偏离也较小,A与c基本上呈直线关系。,2019/6/15,22,由于溶液本身发生化学变化 的原因引起的偏离,由于被测物质在溶液中
9、发生缔合、离解或溶剂化、互变异构、配合物的逐级形成等化学因素,造成对比耳定律的偏离。 Cr2O72- + H2O 2CrO42- + 2H+,橙色,黄色,应控制条件,使溶液中仅存在Cr2O72-或CrO42- ,这样,c与A 之间才成直线,2019/6/15,23,4 比色法和分光光度法及其仪器,目视比色法与光电比色法 分光光度计的基本部件 常用的几种分光光度计,2019/6/15,24,目视比色法,目视比色法是一种用眼睛辨别溶液颜色的深浅,以确定带测组分含量的方法。 常用标准系列法,在一套等体积的比色管中,加入不同体积的标准溶液,分别加入等量显色剂及其它试剂,待测液在同样条件下显色。稀释至刻
10、度,摇匀。比较待测液和标准色阶溶液的颜色深浅,确定待测液的浓度。 目视比色法仪器简单,操作简便,但准确度较差。,2019/6/15,25,光电比色法是在光电比色计上测量一系列标准溶液的吸光度,将吸光度对浓度作图,绘制工作曲线,然后根据待测组分溶液的吸光度在工作曲线上查得其浓度或含量。,2019/6/15,26,光电比色法与目视比色法相比,光电比色法消除了主观误差,提高了测量准确度,而且可以通过选择滤光片和参比溶液来消除干扰,从而提高了选择性。,2019/6/15,27,分光光度计的基本部件,a. 光源 作用:发出所需波长范围内的连续光谱。要求具有足够的辐射强度、较好的稳定性、较长的使用寿命。
11、可见光区常用钨灯、或碘钨灯,波长范围:3202500 nm,2019/6/15,28,b. 单色器 作用:将光源发出的连续光谱分解为单色光。单色器由棱镜和光栅等色散元件及狭缝和透镜组成。 入射狭缝:光源的光由此进入单色器; 准光装置:透镜或返射镜使入射光成为平行光束; 色散元件:将复合光分解成单色光;棱镜或光栅; 聚焦装置:透镜或凹面反射镜,将分光后所得单色光聚焦至出射狭缝; 出射狭缝。,2019/6/15,29,c. 吸收池 作用:用于盛放试样溶液。也叫比色皿。 吸收池主要有石英和玻璃两种。在紫外区须采用石英吸收池,可见区一般用玻璃吸收池。 吸收池大多是长方形的,一般仪器都配有一套厚度为0.
12、5、1、2、3cm的吸收池。吸收池放置的位置应使透光面垂直于光束方向。,2019/6/15,30,d. 检测系统 作用:将光强度转化为电流进行测量。光电转换器对测定波长范围内的光有快速灵敏的响应,产生的电流应与光电转换器上的光强度成正比。 常用的光电转换器有硒光电池、光电管。 e.读数指示器 作用:把光电流或放大的信号以适当的方式显示或记录下来。,2019/6/15,31,常用的几种分光光度计,72型、722型、751型等。,2019/6/15,32,比色分析是否等同于分光光度分析?,光电比色计和紫外可见分光光度计的光路结构非常相似,它们之间不同的地方在于: 分光光度计采用棱镜或光栅作色散元件
13、,因而可以得到纯度较高的单色光束。而光电比色计采用滤光片,只能得到一定波长范围的光谱带(复合光);,2019/6/15,33,紫外可见分光光度计采用紫外和可见区的光源,即氢灯和钨灯,而光电比色计只用一种钨灯光源,因而前者适用于紫外可见光谱区,而后者只适用于可见光谱区;,2019/6/15,34,紫外可见分光光度计可以测定待测组分的精细吸收光谱,不仅可用于定量分析,而且可以作有机化合物的定性和结构分析,而光电比色计只能作定量分析;,2019/6/15,35,分光光度计一般都采用灵敏度高的光电倍增管作检测器,而光电比色计一般用光电池或光电管作检测器。因此,光电比色计无论在测量的准确度、灵敏度和应用
14、范围上都不如紫外可见分光光度计。,2019/6/15,36,比色法是以生成有色化合物的显色反应为基础的,一般包括两个步骤:首先是选择适当的显色试剂与待测组分反应,形成有色化合物,然后再比较或测量有色化合物的颜色深度。,反应,显色剂+待测组分,测定颜色深浅,显色反应尤为重要,5 显色反应及显色条件的选择,2019/6/15,37,(1)对显色反应的要求,将待测组分转化为有色化合物的反应叫显色反应。 显色反应有配位反应和氧化还原反应 。 1.灵敏度高 因为光度法一般用于测定微量组分含量,故通常选择灵敏度高的显色反应。生成的有色化合物摩尔吸光系数大,灵敏度高,通常 k 值达104105,认为灵敏度较
15、高。 2.选择性好 即显色剂只与一种或少数几种物质反应而显色。 3.有色化合物组成固定,化学性质稳定 4.显色剂在测定波长处无明显吸收,2019/6/15,38,(2)显色反应条件的选择,a显色剂的用量 通常显色反应可用下式表示: M(被测离子) + HR(显色剂) MR + H+,从平衡角度看,显色剂过量越多,越有利于有色配合物的形成。但显色剂过量太多,有时会引起副反应,故有一适宜用量,通常由实验确定。,固定其它条件,改变显色剂的浓度,测A,作A c R曲线,选择原则:选择曲线上平坦部分,2019/6/15,39,(a)适合进行光度分析(对显色剂浓度控制不严格) (b)只能选择较窄的显色剂浓
16、度范围 (c)必须严格控制显色剂浓度。,2019/6/15,40,b. 酸度 酸度对显色反应的影响是多方面的: H+浓度大,不利于有色配合物的形成;酸度还影响有些显色剂的颜色;某些被测组分与显色剂能形成不同组成的配合物;金属离子在酸度下降时会水解。 适宜的酸度范围由实验确定:固定其它条件,改变pH值测A,作A pH曲线,选择曲线平坦部分对应的pH值作为测量条件。,2019/6/15,41,吸光度与pH关系曲线,2019/6/15,42,c显色时的温度和时间 多数显色反应在室温下能很快进行,有些反应需要加热。多数显色反应须经一定时间才能完成,有些有色物质放置时受到空气和光的作用,颜色会减弱。 适
17、宜显色时间可通过实验确定。,2019/6/15,43,(1) 随着时间的增加,有色化合物的浓度增大,A增大。反应完成后,A保持不变。,(2)有色化合物性质不太稳定,随着放置时间的增加,在日光,空气的的作用下,有色化合物分解,浓度下降,A降低。,2019/6/15,44,d. 溶剂的影响 许多有色配合物在水中解离度较大,而在有机溶剂中解离度较小。有些配合物易溶于有机溶剂。 e.干扰物质的影响及消除 干扰离子本身有颜色或与显色剂作用显色等,都将干扰测定。 消除干扰的方法有: (1)加掩蔽剂 (2) 选择适当的显色条件 如通过控制酸度,使干扰离子不作用 (3) 选择适当的测量条件 如波长、参比溶液等
18、 (4) 分离干扰离子,2019/6/15,45,入射光波长的选择,入射光波长应根据吸收光谱曲线选择。 1) 在一般情况下选择最大吸收波长作为入射光的波长,因此时k 最大,测定的灵敏度高; 2) 如干扰物在待测物的最大吸收波长处有强烈的吸收,则选择非最大吸收波长作为入射光的波长,这时灵敏度虽有下降,但却消除了干扰。,分光光度法仪器测量误差及其消除,2019/6/15,46,曲线A为钴络合物的吸收曲线 曲线B为显色剂的吸收曲线,吸光度测定条件的选择,2019/6/15,47,光度计读数范围的选择,任何光度计都有一定的测量误差,误差来源于:入射光源不稳定;吸收池玻璃厚薄不均匀;池壁不够平行、表面有
19、水迹、油污或划痕等;光电池不灵敏、疲劳现象及检流计刻度不准等。以上因素造成测量误差的总和,表现为透光度读数误差T。T与c之间是对数关系,同样的T对不同浓度造成的c不同。 在不同的吸光度范围内读数,引入的浓度测量误差是不同的,因此必须选择合适的吸光度读数范围。,2019/6/15,48,为了减小测量的相对误差可采取如下措施: (1) 控制溶液的浓度,如改变试样的称出量或改变稀释度等。 (2)如溶液已显色,则可选择合适厚度的比色皿,使吸光度在上述范围内。,2019/6/15,49,参比溶液的选择,参比溶液用来调节仪器的零点,以消除吸收池壁及溶剂等对入射光的反射和吸收带来的影响,使测得的吸光度能真正
20、反映被测物质的含量。 选择参比溶液的原则: (1) 如果仅所测物质有吸收,显色剂及其它试剂均无吸收,可用纯溶剂作参比,如蒸馏水; (2) 如显色剂和其他试剂略有吸收,则应用不含被测组分的试剂溶液(空白溶液)作参比溶液;,2019/6/15,50,(3) 如果试样中其他组分有吸收,但不与显色剂作用,当显色剂无吸收时,可用试样溶液(不加显色剂)作参比;当显色剂也略有吸收,或干扰离子也与显色剂作用且产物有吸收,可在试液中加掩蔽剂,掩蔽待测组分,再加显色剂,以此溶液作参比。,2019/6/15,51,溶液浓度的测定,工作曲线法 配制一系列不同浓度的被测组分的标准溶液,在选定的max和最佳操作条件下,测
21、得吸光度,作工作曲线(A c),为一直线,也叫标准曲线。在完全相同条件下,测得试样溶液的吸光度,从工作曲线上查得相应浓度。,2019/6/15,52,6、影响比色分析的因素,溶剂的种类和性质; 络合物的电离度; 所用的试剂浓度; 反应系统中氢离子浓度; 试样放置时间; 试样及环境的温度; 反应系统中离子的干扰; 仪器及实验过程中的操作误差。,2019/6/15,53,一、比色分析,比色法:以生成有色化合物的显色反应为基础,通过比较或测量有色物质溶液颜色深度来确定待测组分含量的方法,比色法为一种定量分析的方法。,第二节 应用实例,二、分光光度分析,2019/6/15,54,1 啤酒色度的测定 啤
22、酒色度是指啤酒颜色的深浅,是啤酒常规化验项目之一啤酒色度的高低,主要取决于制麦工艺,但与糖化、发酵等其他工艺也有关。,2019/6/15,55,啤酒色度的测定方法是以碘液做标准,取100毫升水,向其中滴加0.1N碘液,滴定至于啤酒颜色一致,所消耗碘液毫升数,即为啤酒色度。,方法一、,2019/6/15,56,操作步骤,试剂,0.1N的碘液、超纯水,2019/6/15,57,实验结果,色度(0.1N碘液毫升数/100毫升) = 消耗碘液毫升数X(碘液实际当量浓度/0.1),2019/6/15,58,方法二,1原理 将除气后的啤酒注入 EBC 比色计的比色皿中,与标准 EBC 色盘比较,目视读数或
23、自动 数字显示出啤酒的色度,以 EBC 色度单位表示。,EBC欧洲啤酒协会,简称“欧啤协。” Europe Beer consortium,2019/6/15,59,2仪器 EBC 比色计(或使用同等分析效果的仪器):具有 2.O27.0 EBC 单位的目视色度盘或自 动数据处理与显示装置。,2019/6/15,60,一般淡色啤酒的色度在 5.014.0 EBC 范围内;浓色啤酒的色度在 15.040.0 EBC 范围内。 测定浓色或黑色啤酒时,需要将啤酒稀释至合适的色度范围(即2.027.0 EBC 范围内),然后将实验结果乘以稀释倍数。,2019/6/15,61,2 白酒中甲醇含量的检测
24、甲醇对人体的毒性较大,4-10g即可引起严重中毒,尤其是甲醇的氧化物甲酸和甲醛。急性中毒,头痛、恶心、视力模糊等,呼吸中枢麻痹,昏迷甚至死亡。慢性中毒表现为粘膜刺激症状,昏睡、头痛、消化障碍、视力模糊、耳鸣等,以致双目失明。,2019/6/15,62,甲醇的检测原理,酒中甲醇在磷酸溶液中被高锰酸钾氧化为甲醛,过量的高锰酸钾及在反应中产生二氧化锰用硫酸草酸溶液除去,甲醇与品红亚硫酸作用生成蓝紫色醌型色素,与标准系列比较定量。,2019/6/15,63,仪器与试剂,1高锰酸钾磷酸溶液:称取3g高锰酸钾。加入15mL85%磷酸与70mL水的混合液中,溶解后加水至100mL,贮于棕色瓶内,防止氧化力下
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