第03章层析技术dun1.ppt
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1、第三章 层析技术 chromatography technology,层析法又称色层分析法或色谱法 1903-1906年,俄国植物学家M. Tswett首先系统提出来的。 将叶绿素的石油醚溶液通过CaCO3管柱,并继续以石油醚淋洗,由于CaCO3对叶绿素中各种色素的吸附能力不同,色素被逐渐分离,在管柱中出现了不同颜色的谱带或称色谱图(Chromatogram)。,1931年将该方法应用到分离复杂的有机混合物,人们才发现了它的广泛用途。 英国生物学家Martin和Synge,首先提出了色谱塔板理论。并根据液-液逆流萃取的原理,发明了液-液分配色谱。 他们预言:一、流动相可用气体代替液体,与液体相
2、比,物质间的作用力减小了,这对分离更有好处;二、使用非常细的颗粒填料并在柱两端施加较大的压差,应能得到最小的理论塔板高(即增加了理论塔板数),这将会大大提高分离效率。,前者预见了气相色谱的产生,并在1952年诞生了气相色谱仪,它给挥发性的化合物的分离测定带来了划时代的变革; 后者预见了高效液相色谱(HPLC)的产生,在60年代末也为人们所实现。 Martin和Synge于1952年被授予诺贝尔化学奖。 如今的色层分析法经常用于分离无色的物质,已没有颜色这个特殊的含义。但色谱法或色层分析法这个名字仍保留下来沿用。现在我们简称为层析法或层析技术。,第三章 层析技术,第一节 层析的原理 第二节 层析
3、法的分类 第三节 层析法常用实验技术 第四节 柱层析的基本装置及基本操作 第五节 凝胶层析 第六节 离子交换层析 第七节 亲和层析,1.1 固定相 固定相是层析的一个基质。它可以是固体物质(如吸附剂、凝胶、离子交换剂等),也可以是液体物质(如固定在硅胶或纤维素上的溶液),这些基质能与待分离的化合物进行可逆的吸附、溶解、交换等作用。 固定相对层析的效果起着关键的作用。,第一节 层析的原理,1.2 流动相 在层析过程中,推动固定相上待分离的物质朝着一个方向移动的液体、气体等,都称为流动相。 柱层析中一般称为洗脱剂 薄层层析时称为展层剂。,1.3 分配系数 分配系数是指在一定的条件下,某种组分在固定
4、相和流动相中含量(浓度)的比值,常用K来表示。 K=Cs/Cm Cs: 固定相中的浓度 Cm: 流动相中的浓度。 K为热力学常数:与组分性质、固定相性质、流动相性质及温度有关。实验条件固定,K仅与组分性质有关,是层析中分离纯化物质的主要依据,分配系数与温度的关系: lnK = (G0/RT) K为分配系数(或平衡常数),G0为标准自由能变化,R为气体常数,T为绝对温度 这是层析分离的热力学基础。一般情况下,层析时组分的G0为负值,则温度与分配系数成反比关系。 通常温度上升20,K值下降一半,它将导致组分移动速率增加。这也是为什么在层析时最好采用恒温柱的原因。 对于K值相近的不同物质,可通过改变
5、温度的方法,增大K值之间的差异,达到分离的目的。,1.4 保留时间tR 从进样开始到某组分色谱峰顶(浓度极大点)的时间,即组分在色谱柱中的停留时间或组分流经色谱柱所需要的时间。 1.5 死时间t0或tm 分配系数为零的组分的保留时间,即组分在流动相中的停留时间或流动相流经色谱柱所需要的时间(又称流动相保留时间)。,1.6 迁移率(或比移值) 在一定条件下,在相同的时间内某一组分在固定相移动的距离与流动相本身移动的距离之比值。常用Rf来表示。 Rf小于或等于1。 K增加,Rf减少;反之, K减少,Rf增加。,1.7 相对迁移率 在一定条件下,在相同时间内,某一组分在固定相中移动的距离与某一标准物
6、质在固定相中移动的距离之比值。 可以小于等于1,也可以大于1。 用Rx来表示。不同物质的分配系数或迁移率是不同的。分配系数或迁移率的差异程度是决定几种物质采用层析方法能否分离的先决条件。很显然,差异越大,分离效果越理想。,1.8 分辨率(或分离度) 相邻两个峰的分开程度。用Rs来表示。,Rs值越大,两种组分分离的越好。,Rs值越大,两种组分分离的越好。 当Rs = 1时,两组分具有较好的分离,互相沾染约2%,即每种组分的纯度约为98%。 当Rs=1.5时,两组分基本完全分开,每种组分的纯度可达到99.8%。 如果两种组分的浓度相差较大时,尤其要求较高的分辨率。,1.9 操作容量(或交换容量)
7、在一定条件下,某种组分与基质(固定相)反应达到平衡时,存在于基质上的饱和容量,我们称为操作容量(或交换容量)。 数值越大,表明基质对该物质的亲合力越强。 同一种基质对不同种类分子的操作容量是不相同的,这主要是由于分子大小(空间效应)、带电荷的多少、溶剂的性质等多种因素的影响。 实际操作时,加入的样品量要尽量少些,特别是生物大分子,样品的加入量更要进行控制,否则用层析办法不能得到有效的分离。,第二节 层析法的分类,2.1 按两相所处状态分类,2.2 按层析原理分类,2.3 按操作形式不同分类,2.4 正相色谱与反相色谱 正相色谱是指固定相的极性高于流动相的极性,因此,在这种层析过程中非极性分子或
8、极性小的分子比极性大的分子移动的速度快,先从柱中流出来。 反相色谱是指固定相的极性低于流动相的极性,在这种层析过程中,极性大的分子比极性小的分子移动的速度快而先从柱中流出。 一般来说,分离纯化极性大的分子(带电离子等)采用正相色谱(或正相柱),而分离纯化极性小的有机分子(有机酸、醇、酚等)多采用反相色谱(或反相柱)。,第三节 层析法常用实验技术,3.1 纸层析(paper chromatography) 3.2 薄层层析(thin-layer chromatography,TLC) 3.3 离子交换层析(ion exchange chromatography) 3.4 亲和层析(affinit
9、y chromatography) 3.5 凝胶层析法(gel chromatography) 3.6 高效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC): 3.7 气相色谱(gas chromatography,GC),3.1 纸层析(paper chromatography) 纸层析是以滤纸作为支持物的分配层析。 滤纸纤维与水有较强的亲和力,能吸收22%左右的水,其中6%7%的水是以氢键形式与纤维素的羟基结合。 滤纸纤维与有机溶剂左右的亲和力很弱。 滤纸纤维及其结合的水作为固定相,有机溶剂作为流动相。,纸层析对混合物进行分离时,发生两种作
10、用,混合物的彼此分离是这两种因素共同作用的结果。 第一种是溶质在结合于纤维上的水与流过滤纸的有机相进行分配(即液-液分离) 第二种是滤纸纤维对溶质的吸附及溶质溶解于流动相的不同分配比进行分配(即固-液分配)。,双向纸层析法 在样品所含溶质较多或某些组分在单相纸层析中的Rf比较接近,不易明显分离时采用此法。 该法是将滤纸在某一特殊的溶剂系统中按一个方向展层以后,即予以干燥。 转向90度,在另一溶剂系统中进行展层,待溶剂到达所要求的距离后,取出滤纸,干燥显色,从而获得双向层析谱。 纸层析还可以与区带电泳法结合,能获得更有效的分离方法,这种方法称为指纹谱法。,3.2 薄层层析(thin-layer
11、chromatography,TLC) 薄层层析是在玻璃板上涂布一层支持剂,待分离样品点在薄层板一端,然后让推动剂从上流动,从而使各组分得到分离的物理方法。 常用的支持剂有:硅胶G、硅胶GF、氧化铝、纤维素、硅藻土、硅胶G硅藻土、纤维素G、DEAE-纤维素、交联葡聚糖凝胶等。 使用的支持剂种类不同,其分离原理也不尽相同,有分配层析、吸附层析、离子交换层析、凝胶层析等多种。,薄层层析设备简单,操作简单,快速灵敏。 改变薄层厚度,既能作分析鉴定,又能做少量制备。 配合薄层扫描仪,可以同时做到定性定量分析,在生物化学、植物化学等领域是一类广泛应用的物质分离方法。,3.3 离子交换层析(ion exc
12、hange chromatography) 离子交换层析是利用离子交换剂上的可交换离子与周围介质中被分离的各种离子间的亲和力不同,经过交换平衡达到分离的目的的一种柱层析法。 该法可以同时分析多种离子化合物,具有灵敏度高,重复性、选择性好,分离速度快等优点,是当前最常用的层析法之一。 常用于多种离子型生物分子的分离,包括蛋白质、氨基酸、多肽及核酸等。,3.4 亲和层析(affinity chromatography) 亲和层析是利用某些生物分子之间专一可逆结合特性、高度专一的吸附层析类型。 固体基质具有一个与之共价相连的特殊结合分子(如配位体),连接后的配体对互补分子的亲和力不会改变。 配体是发
13、生亲和反应的功能部位,也是载体和被亲和分子之间的桥梁。配体本身必须有两个基团:一个能与载体共价结合,一个能与被亲和分子结合。 配基的固定化方法有载体结合法、物理吸附法、交联法和包埋法等四类方法。,3.5 凝胶层析法(gel chromatography) 凝胶层析法也称分子筛层析法,是指混合物随流动相经过凝胶层析柱时,其中各组分按其分子大小不同而被分离的技术。 该法设备简单、操作方便、重复性好、样品回收率高,除常用于分离纯化蛋白质、核酸、多糖、激素等物质外,还可以用于测定蛋白质的相对分子质量,以及样品的脱盐和浓缩等。 常用的凝胶类型有:交联葡聚糖凝胶,琼脂糖凝胶,聚丙烯酰胺凝胶等。,3.6 高
14、效液相色谱(high performance liquid chromatography,HPLC): 高效液相色谱是一种多用途的层析方法,可以使用多种固定相和流动相,并可以根据特定类型分子的大小、极性、可溶性或吸收特性的不同将其分离开来。 核心部件是耐高压的色谱柱。通常由不锈钢制成,并且所有的组成元件、阀门等都是用可耐高压的材料制成。,溶剂运送系统的选择取决于:等度(无梯度)分离:在整个分析过程中只使用一种溶剂(或混合溶剂);梯度洗脱分离:使用一种微处理机控制的梯度程序来改变流动相的组分,该程序可通过混合适量的两种不同物质来产生所需要的梯度。 由于HPLC的高速、灵敏和多用途等优点,它成为许
15、多生物小分子分离所选择的方法,常用的是反相分配层析法。,3.7 气相色谱(gas chromatography,GC) 现代的气相色谱使用长达50m的毛细管层析柱(内径为0.10.5mm)。 固定相通常为一种交联的硅多体,附着在毛细管内壁成一层膜。在正常操作温度下,其性质类似于液体膜,但要结实的多。 流动相(载气)通常为氮气或氢气。 大多数生物大分子的分离受柱温的影响。柱温有时在分析过程中维持恒定(通常50250),更常见的为设定一个增温的程序(如以每分钟10的速度从50升高到250)。,样品通过一个包含有气紧阀门的注射孔注入柱顶部。 柱中的产物可用下列方法检测出: 1) 火焰离子检测法:流出
16、气体通过一种可使任何有机复合物离子化的火焰,被固定在火焰顶部附近的电极所检测。 2) 电子捕获法:使用一种发射射线的放射性同位素作为离子化的方式。可以检测极微量(pmol)的亲电复合物。 3) 分光光度计法:包括质谱分析法(GC-MS)和远红光谱分析法(GC-IR)。 4) 电导法:流出气体中的组成成分的改变会引起铂电缆电阻的变化。,第四节 柱层析的基本装置及基本操作,柱层析的基本装置,4.1,4.2 柱层析的基本操作 装柱 平衡 加样 洗脱 收集、鉴定及保存 基质(吸附剂、交换树脂或凝胶等)的再生, 装柱 根据层析的基质和分离目的选好柱子。一般柱子的直径与长度比为1:1050;凝胶柱可以选1
17、:100200,同时将柱子洗涤干净。 将层析用的基质(如吸附剂、树脂、凝胶等)在适当的溶剂或缓冲液中溶胀,并用适当浓度的酸(0.5N1N)、碱(0.5N1N)、盐(0.5M1M)溶液洗涤处理,以除去其表面可能吸附的杂质。 然后用去离子水(或蒸馏水)洗涤干净并真空抽气(吸附剂等与溶液混合在一起),以除去其内部的气泡。,关闭层析柱出水口,并装入1/3柱高的缓冲液,并将处理好的吸附剂等缓慢地倒入柱中,使其沉降约3cm高。 打开出水口,控制适当流速,使吸附剂等均匀沉降,并不断加入吸附剂溶液。(吸附剂的多少根据分离样品的多少而定。)注意不能干柱、分层,否则必须重新装柱。 最后使柱中基质表面平坦并在表面上
18、留有23cm高的缓冲液,同时关闭出水口。(采用机械化装柱法在此省略。), 平衡 柱子装好后,要用所需的缓冲液(有一定的pH和离子强度)平衡柱子。 用恒流泵在恒定压力下走柱子(平衡与洗脱时的压力尽可能保持相同)。 平衡液体积一般为35倍柱床体积,以保证平衡后柱床体积稳定及基质充分平衡。 如果需要,可用兰色葡聚糖2000在恒压下走柱,如色带均匀下降,则说明柱子是均匀的。 有时柱子平衡好后,还要进行转型处理。如离子交换层析。, 加样 加样量的多少直接影响分离的效果。 加样时应缓慢小心地将样品溶液加到固定相表面,尽量避免冲击基质,以保持基质表面平坦。 一般讲,加样量尽量少些,分离效果比较好。 通常加样
19、量应少于20%的操作容量,体积应低于5%的床体积,对于分析性柱层析,一般不超过床体积的1%。 最大加样量必须在具体条件下多次试验后决定。, 洗脱 洗脱的方式可分为简单洗脱、分步洗脱和梯度洗脱三种。 简单洗脱:柱子始终用同样的一种溶剂洗脱,直到层析分离过程结束为止。如果被分离物质对固定相的亲合力差异不大,其区带的洗脱时间间隔(或洗脱体积间隔)也不长,采用这种方法是适宜的。 分步洗脱:这种方法按照递增洗脱能力顺序排列的几种洗脱液,进行逐级洗脱。它主要对混合物组成简单、各组分性质差异较大或需快速分离时适用。每次用一种洗脱液将其中一种组分快速洗脱下来。,梯度洗脱:当混合物中组分复杂且性质差异较小时,一
20、般采用梯度洗脱。它的洗脱能力是逐步连续增加的,梯度可以指浓度、极性、离子强度或pH值等。最常用的是浓度梯度。 在水溶液中,亦即离子强度梯度。可形成梯度的形式有三种,如下页图所示。,洗脱条件的选择,也是影响层析效果的重要因素。当对所分离的混合物的性质了解较少时,一般先采用线性梯度洗脱的方式去尝试,但梯度的斜率要小一些,尽管洗脱时间较长,但对性质相近的组分分离更为有利。同时还应注意洗脱时的速率。,流速的快慢将影响理论塔板高度,从而影响分辨率。事实上,速度太快,各组分在固液两相中平衡时间短,相互分不开,仍以混合组分流出。速度太慢,将增大物质的扩散,同样达不到理想的分离效果。只有多次试验才会得到合适的
21、流速。,总之,我们必须经过反复的试验与调整(可以用正交试验或优选法),才能得到最佳的洗脱条件。还应强调的一点是,在整个洗脱过程中,千万不能干柱,否则分离纯化将会前功尽弃。, 收集、鉴定及保存 在生化实验中,基本上我们都是采用部分收集器来收集分离纯化的样品。 由于检测系统的分辨率有限,洗脱峰不一定能代表一个纯净的组分。因此,每管的收集量不能太多,一般1ml-5ml / 管。如果分离的物质性质很相近,可低至0.5ml / 管。,在合并一个峰的各管溶液之前,还要进行鉴定。 例如,一个蛋白峰的各管溶液,我们要先用电泳法对各管进行鉴定。 对于是单条带的,认为已达电泳纯,合并在一起。其他的另行处理。 对于
22、不同种类的物质采用相应的鉴定方法。 为了保持所得产品的稳定性与生物活性,我们一般采用透析除盐、超滤或减压薄膜浓缩,再冰冻干燥,得到干粉,在低温下保存备用。, 基质的再生 许多基质(吸附剂、交换树脂或凝胶等)价格昂贵,可以反复使用多次,所以层析后要回收处理,以备再用,严禁乱倒乱扔。这也是一个科研工作者的科学作风问题。 各种基质的再生方法可参阅具体层析实验及有关文献。,第五节 凝胶层析,5.1 凝胶层析简介 5.2 凝胶层析的基本原理 5.4 凝胶的种类和性质 5.3 凝胶层析的基本概念 5.5 凝胶的选择、处理和保存 5.6 凝胶层析操作中应注意的问题 5.7 凝胶层析的应用,5.1 凝胶层析简
23、介 凝胶层析(gel chromatography)又称为凝胶排阻层析(gel exclusion chromatography)、分子筛层析(molecular sieve chromatography)、凝胶过滤(gel filtration)、凝胶渗透层析(gel permeation chromatography)等。 它是以多孔性凝胶填料为固定相,按分子大小顺序分离样品中各个组分的液相色谱方法。,1959年,Porath和Flodin首次用一种多孔聚合物交联葡聚糖凝胶作为柱填料,分离水溶液中不同分子量的样品,称为凝胶过滤。 1964年,Moore制备了具有不同孔径的交联聚苯乙烯凝胶,
24、能够进行有机溶剂中的分离,称为凝胶渗透层析(流动相为有机溶剂的凝胶层析一般称为凝胶渗透层析)。 随后这一技术得到不断的完善和发展,目前广泛的应用于生物化学、高分子化学等很多领域。 凝胶层析广泛用于蛋白质(包括酶)、核酸、多糖等生物分子的分离纯化,同时还应用于蛋白质分子量的测定、脱盐、样品浓缩等。,5.2 凝胶层析的基本原理,凝胶层析是依据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。层析过程如图 所示。凝胶层析的固定相是惰性的珠状凝胶颗粒,凝胶颗粒的内部具有立体网状结构,形成很多孔穴。当含有不同分子大小的组分的样品进入凝胶层析柱后,各个组分就向固定相的孔穴内扩散,组分的扩散程度取决于孔穴的大小和组分分子
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