第03章细胞生物学研究方法.ppt
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1、,第三章 细胞生物学研究方法,细胞生物学研究思路,进行初步观察,形成可验证的假说,设计对照试验,收集资料,解释结果,作出合理结论,查阅已 有知识,Caenorhabditis elegans,Drosophila melanogaster,Arabidopsis thaliana,生物学研究模式生物,生物学研究模式生物,微生物细胞,病毒,孟加拉斑马鱼,荧光斑马鱼,全身透明斑马鱼,不同物种享有共同分子机制,第三章 细胞生物学研究方法, 细胞形态结构的观察方法 细胞组分的分析方法 细胞培养、细胞工程与显微操作技术,第一节 细胞形态结构的观察方法, 光学显微镜技术(light microscopy)
2、 电子显微镜技术 (Electro microscopy) 扫描探针显微镜(Scanning Probe Microscope) 扫描隧道显微镜 (scanning tunneling microscope ),一、光学显微镜技术(light microscopy),普通复式光学显微镜技术 荧光显微镜技术(Fluorescence Microscopy) 激光共焦扫描显微镜技术(Laser Confocal Microscopy) 相差显微镜(phase-contrast microscope) 微分干涉显微镜(differential interference contrast micros
3、cope, DIC) 录像增差显微镜技术(video-enhance microscopy),普通复式光学显微镜,光镜样本制作,分辨率是指区分开两个质点间的最小距离。,荧光显微镜技术 (Fluorescence Microscopy),原理与应用 直接荧光标记技术 间接免疫荧光标记技术 在光镜水平用于特异蛋白质 等生物大分子的定性定位: 如绿色荧光蛋白(GFP)的应用,荧光显微镜技术原理,体视荧光显微镜,微管呈绿色、微丝红色、核蓝色,直接荧光标记技术,现代生物学的北斗星,2008年度诺贝尔化学奖 授予美国科学家下村修、马丁-查尔菲,华裔化学家钱永健,他们因为发现和发展绿色荧光蛋白(GFP)而获
4、奖的。,多种颜色荧光的大肠杆菌组成的“钱氏实验室”字样,激光共焦扫描显微镜技术 (Laser Scanning Confocal Microscopy),激光共焦扫描显微镜技术原理,应用: 1. 排除焦平面以外光的干扰,增强图像反差和提高分辨率(1.41.7),高品质的荧光成像; 2. 多维观察,重构样品的三维结构; 3. 可进行一二三标记; 4. 动、静态观察; 5. 定性与定量分析。,实 例,美国哈佛大学的吉恩里维特(Jean Livet)使用共焦显微技术(confocal microscopy),拍摄了一只基因工程小鼠的脑干组织切片(厚340m)。(即“脑虹”技术,Brainbow),美
5、国北卡罗来纳大学惠明顿分校的索尼娅派奥特(Sonja Pyott)拍摄到了小鼠内耳毛细胞 .毛细胞为绿色,与毛细胞有突触联系的细胞为红色,蓝色的则是细胞核,相差显微镜(phase-contrast microscope) 将光程差或相位差转换成振幅差,可用于观察活细胞 微分干涉显微镜(differential-interference microscope) 偏振光经合成后,使样品中厚度上的微小区别转化成 明暗区别,增加了样品反差且具有立体感。适于研究活细胞中较大的细胞器,A comparison of yeast cells that were growing on the vaginal
6、epithelium seen with different types of LM. a)under bright-field; b)phase-contrast; c)DIC,录像增差显微镜技术(video-enhance microscopy) 计算机辅助的DIC显微镜可在高分辨率下研究活细胞中的颗粒及细胞器的运动。,二、 电子显微镜技术,电子显微镜的基本知识 电镜与光镜的比较 电镜与光镜光路图比较 电子显微镜的基本构造 主要电镜制样技术 负染色技术 冰冻蚀刻技术 超薄切片技术 电镜三维重构技术 扫描电镜(Scanning electron microscope,SEM) SPM(Sca
7、nning probe microscope),电镜与光镜的比较,电镜与光镜光路图比较,电子显微镜的基本构造,主要电镜制样技术, 超薄切片技术 用于电镜观察的样本制备示意图 负染色技术(Negative staining)与金属投影 染色背景,衬托出样品的精细结构 冰冻蚀刻技术(Freeze etching) (技术示意图) 冰冻断裂与蚀刻复型:主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒 和膜表面结构。 快速冷冻深度蚀刻技术(quick freeze deep etching) 电镜三维重构技术 电子显微术、电子衍射与计算机图象处理相结合而形成的 具有重要应用前景的一门新技术。 电镜三维重构技术与X-射
8、线晶体衍射技术及核磁共振 分析技术相结合,是当前结构生物学(Structural Biology) 主要研究生物大分子空间结构及其相互关系的主要实验手段。,Examples of negtively stained and metal-shadowed specimens. Electron micrographs of a tobacco rattle virus after negtive staining with potassium phosphotungstate(a) or shadow casting with chromium(b).,扫描电镜,原理与应用: 电子“探针”扫描,
9、激发样品表面放出二次电子,探测器收集二次电子成象。 CO 2临界点干燥法防止引起样品变形的表面张 力问题,扫描电镜外观,三、 扫描隧道显微镜,Scanning Probe Microscope,SPM (80年代发展起来的检测样品微观结构的仪器) 包括:STM、AFM、磁力显微镜、摩擦力显微镜等 原理:扫描探针与样品接触或达到很近距离时,即产生彼此间相互作用力,如 量子力学中的隧道效应(隧道电流)、原子间作用力、磁力、摩擦力等, 并在计算机显示出来,从而反映出样品表面形貌信息、电特性或磁特性等。 装置:扫描的压电陶瓷,逼近装置,电子学反馈控制系统和数据采集、处理、显示系统。 特点:(1)可对晶
10、体或非晶体成像,无需复杂计算,且分辨本领高。 (侧分辨率为0.10.2nm,纵分辨率可达0.01nm); (2)可实时得到样品表面三维图象,可测量厚度信息; (3)可在真空、大气、液体等多种条件下工作;非破坏性测量。 (4)可连续成像,进行动态观察 用途:纳米生物学研究领域中的重要工具,在原子水平上揭示样本表面的结构。,透射电镜外观,透射电镜下的细胞,活细胞工作站可实现在细胞水平上的定性和定量分析、活细胞图像处理、活细胞动态示踪。在分子水平,可做到基因定位定量表达的动态分析、蛋白质合成降解运输和相互作用的动态研究、细胞骨架的代谢动力学测定和细胞周期各时相的动态观察等。 现在市场上使用的活细胞工
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- 03 细胞生物学 研究 方法
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