蛋白互作研究方法.ppt
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1、蛋白质相互作用 研究方法,王心宇,College of Life Sciences,1 研究蛋白质相互作用的意义 随着生命现象的研究逐渐由获取基因序列信息转向研究基因功能,一门新的学科蛋白质组学proteomics应运而生。蛋白质组是一个在空间和时间上动态变化的整体,其功能往往是通过蛋白质之间或与核酸之间相互作用而表现出来的,这种相互作用存在于机体每个细胞的生命活动过程中,相互交叉形成网络,构成细胞中一系列重要生理活动的基础。因此,对于蛋白质相互作用interactome的研究就成为蛋白质组学中最主要研究内容之一。,2 蛋白质相互作用常用研究方法 1 酵母双杂交(Yeast two-hybri
2、d,Y2H) 2 pull-down 3 免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation,Co-IP) 4 双分子荧光互补技术(Biomolecular fluorescence complementation,BiFC or Split YFP) 5 Far-western analysis,3 酵母双杂交技术 3.1 原理,DNA-binding and activating functions in a transcription factor may comprise independent domains of the protein.,The two hybrid tec
3、hnique tests the ability of two proteins to interact by incorporating them into hybrid proteins where one has a DNA-binding domain and the other has a transcription-activating domain.,3.2 酵母双杂交文库构建与筛选 BD Matchmaker Library Construction & Screening Kits,诱饵蛋白载体构建,pGADT7-Rec Vector Information,文库构建,Con
4、structing AD fusion libraries by recombination-mediated cloning in yeast.,cDNA library of oilseed rape line RS-1 constructed in yeast,Yeast cells that are mating. A zygote typically has three-lobed shape, the lobes representing the two haploid(parental) cells and the budding diploid cells.,Library s
5、creening by mating,Positive clones confirmed on SD/-Ade/-His/-Leu/-Trp/X-a-Gal,检测特定两个蛋白是否互作,pGADT7 Vector Information,3.3 膜蛋白互作研究方法 基于泛素的酵母双杂交体系(mating-based Split ubiquitin system “mbSUS“) 1)GAL4体系的缺点 2) MbSUS 体系,mbSUS 原理,In vivo cloning into mbSUS vectors,GATEWAY cloning method,4 pull down 1) 原理,2
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