蛋白质免疫印迹技术.ppt
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1、实验二 蛋白质免疫印迹技术,一、免疫学,研究抗原物质的结构和功能; 免疫应答产物的结构和功能; 抗原刺激机体产生免疫应答的规律。,免疫学的研究范围很广,与很多相关学科交织在一起,并且发展成了很多学科,如免疫生物学、免疫遗传学、血液免疫学、肿瘤免疫学等。 随着免疫生物学的发展,人们发现在高等动物体内存在着具有免疫功能的组织结构(即免疫系统)。,淋巴组织,免疫活性细胞,免疫活性介质,免疫系统功能的生理和病理表现,功能名称 生理功能 病理表现,免疫防御 清除病原微生物及其它抗原性异物 超敏反应(强) 免疫缺陷病(弱) 免疫自稳 清除损伤或衰老细胞 自身免疫性疾病 免疫监视 清除突变或畸变细胞 防止肿
2、瘤发生 肿瘤或病毒持续性 杀伤病毒感染细胞 感染,当外源异体物质,如细菌、病毒、蛋白质、多糖等进入动物机体后,可以激活机体免疫系统,产生对外源物质的排除作用,从而保护机体免受外源物质的侵害。 机体的这一特异免疫应答功能的细胞基础是淋巴细胞。,免疫应答的类型 (一)固有性免疫应答(innate immune response) 又称先天性免疫应答,非特异性免疫应答:是机体在种系发育和进化过程中形成的免疫防御功能。 (二)适应性免疫应答(adaptive immune response) 又称获得性免疫应答,特异性免疫应答,是机体出生后通过与抗原物质接触后所产生的一系列防御功能。(具有特异性、多样
3、性、记忆性、耐受性、自限性),抗原和免疫原性,抗原(antigens,Ag)是指能够刺激机体免疫活性细胞产生抗体或致敏淋巴细胞,并在体内或体外发生特异性反应的物质。 常见的抗原有蛋白质、多糖、磷脂、脂多糖、结合蛋白质、核酸、激素等有机物。 抗原具有两方面的特性:免疫原性(immunogenicity)和免疫反应性(immunoreactivity)。 免疫原性(immunogenicity)是指抗原刺激机体引起免疫应答的能力。 免疫反应性(immunoreactivity)是指抗原与相应免疫应答产物(即抗体)在体内或体外发生特异性结合反应的能力。,抗原的分类,抗原可以分为完全抗原和半抗原。 完
4、全抗原:具有免疫原性和免疫反应性的抗原称为完全抗原(complete antigen) 半抗原:只具有免疫反应性而无免疫原性的抗原称为半抗原(hapten),也称为不完全抗原(incomplete antigen)。与蛋白质结合后成为完全抗原。半抗原能与相应的抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合反应。绝大多数多糖和所有类脂都属于半抗原。,抗体的种类,抗体(antibodies,Ab)是专门对抗抗原特异结构的球蛋白,故也称为免疫球蛋白(immunoglobulins, Ig)。存在于血清、体液中,是构成机体免疫作用的主要物质。 免疫球蛋白依据其理化性质及生化性质的不同,分为五种类型: IgG、 Ig
5、A、 IgM、 IgD和IgE。 人体血清中IgG含量最多, IgA次之, IgM较少, IgD和IgE微量。,抗原抗体反应(antigen-antibody reaction) 是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。可发生于体内(in vivo),也可发生于体外(in vitro)。 体内反应可介导吞噬、溶菌、杀菌、中和毒素等作用; 体外反应:可出现凝集反应、沉淀反应、补体参与的反应及中和反应等各种不同的反应类型。 因抗体主要存在于血清中,在抗原或抗体的检测中多采用血清作试验,所以体外抗原抗体反应亦称为血清学反应(serologic reaction)。,二、印迹法(blotting
6、),印迹法是指将样品转移到固相载体上,而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。 1975年,Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜(NC膜)上,并利用DNARNA杂交检测特定的DNA片段的方法,称为Southern 印迹法。 人们用类似的方法,对RNA和蛋白质进行印迹分析,对RNA的印迹分析称为Northern印迹法,对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western印迹法,对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern印迹法,三、蛋白免疫印迹的应用,免疫印迹法 (immunoblotting test,IBT),亦称酶联免疫电转移印斑法(enzyme linked imm
7、unoelectrotransfer blot,EITB 是一种将高分辨率凝胶电泳和免疫化学分析技术相结合的杂交技术。 具有分析容量大、敏感度高、特异性强等优点。 是检测蛋白质特性、表达与分布的一种最常用的方法。,蛋白质免疫印迹检测技术,一、实验目的 二、实验原理 三、实验仪器 四、操作步骤 五、实验结果与分析 六、思考题,一、实验目的,学习掌握动物抗血清的制备原理及技术 通过实际操作学会动物抗血清的制备 掌握Westernblotting的基本原理 熟悉Westernblotting的实验操作,二、实验原理,第一部分 动物的常规免疫及抗血清的制备 第二部分 Westernblotting 检
8、测抗血清,将适当的抗原物质注入动物体内,经过一定时间,动物血清中可出现大量特异性抗体,这种含抗体的血清称为免疫血清。 优质免疫血清的产生,主要取决于抗原的纯度和免疫原性,以及动物应答的能力。此外,尚需考虑免疫途径、抗原剂量、注射次数、时间间隔、有无佐剂等因素。,第一部分 动物的常规免疫及抗血清的制备,(一)多克隆抗体的概念,抗原通常是由多个抗原决定簇组成的。 由一种抗原决定簇刺激机体,由一个B淋巴细胞接受该抗原所产生的抗体称之为单克隆抗体(Monoclone antibody)。 由多个抗原决定簇刺激机体,相应地就产生各种各样的单克隆抗体,这些单克隆抗体混杂在一起就是多克隆抗体。 机体内所产生
9、的抗体就是多克隆抗体。,抗体的结构,(二)用于免疫的动物,由于动物的遗传性不同,同一抗原对不同动物或同种不同品系动物、或不同个体,产生特异免疫应答的强弱是不同的。因此,进行动物免疫时,必须选择对该抗原敏感的、年轻的健康动物。 常用的实验动物为羊、家兔、豚鼠和鼠等。一般为6个月大小的动物。,动物种类的选择主要根据抗原的生物学特性和所要获得抗血清数量。 如要获得大量的抗体,多采用大动物; 如要是获得直接标记诊断的抗体,则直接采用本动物; 如要获得间接的标记诊断用抗体,则必须用异源动物制备抗体; 如果难以获得的抗原,且抗体的需要量少,则可以采用纯系小鼠制备。 一般实验室采用的抗体,多用兔和羊制备,因
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