蛋白质结构与功能的NMR研究2.ppt
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1、蛋白质分子溶液结构与功能的NMR研究部分,蛋白质的NMR研究内容,蛋白质溶液三级结构的测定 蛋白质的构象变化 蛋白质与靶分子(靶蛋白、核酸、配体小分子、药物)的相互作用 蛋白质的动态特性 蛋白质的折叠机制和折叠路径,一. 确定生物分子的溶液三维结构,蛋白质分子:天然态蛋白质、突变体蛋白质、部分折叠态蛋白质、非天然态蛋白质。 核酸分子:DNA、RNA 蛋白质复合物:蛋白质与蛋白质复合物、蛋白质与DNA或RNA复合物,蛋白质与药物小分子复合物、蛋白质与拮抗剂小分子复合物。,蛋白质溶液三维结构确定的技术基础,高场核磁共振波谱仪的发展 500MHz600 MHz750 MHz800 MHz900 MH
2、z 多维(二维、三维、四维)核磁共振实验技术的发展 梯度场多维NMR脉冲程序 TROSY类型多维NMR脉冲程序 取向介质中蛋白质残余偶极相互作用检测方法 处理和解析多维核磁共振数据的软件开发研究,蛋白质溶液三维结构确定的重要性,蛋白质结构与功能关系研究的重要部分 蛋白质一级结构决定三级结构研究的基础 可在结构基础上研究蛋白质发挥生理功能的活性部位 可在结构基础上研究蛋白质内运动与功能特性的关系 蛋白质动态特性与结构特性密切相关,二. 天然态蛋白质结构功能研究,蛋白质与药物小分子、拮抗剂等结合的活性部位确定 蛋白质发挥生理功能时活性部位的构象变化 蛋白质动态特性与功能的关系 蛋白质折叠/去折叠
3、蛋白质稳定性 蛋白质在水溶液中多构象的平衡 蛋白质肽键的顺反异构与功能关系 蛋白质中的水分子,Research: 3D solution structure NOE, 3JN, 3J , Hydrogen-bond binding site NOE, , 3JN, 3J , Hydrogen-bond conformational change NOE, , 3JN, 3J , Hydrogen-bond folding/unfolding NOE, , H , 3JN backbone dynamics 15N-T1, 15N-T2, 15N-NOE, H/D exchange protei
4、n-protein interaction NOE, , H protein-nucleic acid interaction NOE, , H,三. 蛋白质复合物相互作用的研究,蛋白质与蛋白质相互作用研究 蛋白质与核酸相互作用研究 蛋白质与拮抗剂和底物小分子相互作用 靶蛋白质与药物小分子相互作用,Research: conformation of the complex conformation of protein conformation of substrate, peptide, - binding site on protein binding interface Methodol
5、ogy: isotope labeling of protein isotope labeling of nucleic acid isotope labeling of peptide hetero-nuclear filtering NMR experiments docking by using software package,四. 非天然态蛋白质的研究 蛋白质片段的溶液构象 变性剂作用下蛋白质的动态特性变化 脲变性、酸变性蛋白质的特性与残存结构 五. 膜蛋白质分子的研究 膜蛋白质与膜脂分子相互作用,Study of non-native protein,Research: refol
6、ding process of protein dynamic properties of non-native protein residual structures of protein Problems: extensive overlap of peaks reducing the NOEs averaged over an ensemble of conformations broad line widths Methodology: isotope labeling of protein site-directed mutagenesis hydrogen-exchange pul
7、se labeling,多维NMR研究蛋白质溶液三维空间结构及功能关系,NMR 方法是确定蛋白质溶液三维结构的唯一有效手段,确定蛋白质溶液三维结构的重要性: 蛋白质结构与功能关系研究的重要部分 蛋白质一级结构决定三级结构研究的基础 是研究蛋白质发挥生理功能的活性部位的必要条件 可在结构基础上研究蛋白质内运动与功能特性的关系 蛋白质动态特性与结构特性密切相关,(1) 多维NMR确定蛋白质分子溶液 三维结构的基础, 蛋白质的结构信息 20种氨基酸:氨基酸由H、C、N、O、S等元素组成,提供链长和键角信息。 蛋白质的一级结构:多肽链中氨基酸残基序列。提供蛋白质的氨基酸组分,排列顺序以及各类原子数。
8、蛋白质的二级结构:蛋白质分子不同肽段主链原子在三维空间中不同的排列规律性,表现为-螺旋,-片层、转角和环等基本结构单元。在不同二级结构单元的肽段中,肽键的二面角不同,主链氢原子间的相对位置或距离不同。 蛋白质的三级结构:蛋白质的二级结构单元在三维空间中的相对排列,提供原子间的远程距离信息。, 核磁共振波谱信息 化学位移:氨基酸的H、C原子的核磁共振峰在-螺旋与链中的化学位移分布呈现规律性的差异。 J-偶合:反映了肽键的二面角(,)大小。 - 螺旋和片层二级结构单元中的J-偶合数值范围不同。 NOE:核自旋之间的偶极偶极相互作用产生的交叉驰豫导致NOE现象,在两个核之间的距离小于5时可以观察到N
9、OE信号。, 波谱信息与结构信息的对应 化学位移可以直接用作判别形成螺旋、片层的氨基酸残基肽段的实验依据。 J耦合可用以直接确定肽键的二面角,。 NOE信号强度与两个核之间的距离六次方成反比。由NOE强度可以确定两个原子之间的距离,在螺旋与片层中氢原子之间的NOE强度呈现不同的特征。可用以精确地测定螺旋与片层。由主链原子间远程相互作用提供的NOE可以精确地测定蛋白质分子的三级折叠。,多维NMR确定蛋白质分子溶液三维结构的流程图,NMR研究蛋白质中存在的问题,同核(1H-1H)NMR在确定蛋白质溶液的结构方面,可以获得小于100个残基的小蛋白的溶液结构,在准确度方面类似于2.0-2.5 分辨率的
10、晶体结构 随着蛋白质分子量的进一步提高,由于化学位移的重叠或简并,使得在(1H-1H)NMR方法中所使用的自旋系统识别和序列识别方法不再完全有效 其次是随着分子量增加,谱线变宽,因而使得较难利用建立在小的同核耦合(耦合常数12Hz)之上的一些位移相关实验,金黄色葡萄球菌核酸酶 920 1H resonances in 10 ppm 722 13C resonances in 185 ppm 143 15N resonances in 220 ppm,小蛋白和大蛋白二维同核NMR谱的比较,BmP02(28个残基) ADR6(115个残基) 部分NOESY谱,增加NMR波谱的维数,从二维扩展到四维
11、可提高谱图分辨率,二维 三维 四维,1H/13C/15N多维核磁共振波谱示意图,单键异核耦合用于磁化强度传递,磁化矢量之间的传递是建立不同自旋之间联系的方式,也是多维核磁共振方法的基础。 溶液核磁共振方法中常见的传递方式,一是通过跨键连接,也就是标量耦合进行传递,如同核传递,异核传递;二是通过跨空间相互作用。 对于1H 的同核传递通过3JHH,一般取1/(2*3JHH) ,约3080ms 。 对于脂肪链13C 同核传递通过1JCC 传递,一般取3/(4*1JCC),约1020ms。 对于1H-13C 的异核传递通过1JCH,一般取0.8/1JCH,约6.7ms。,蛋白质分子稳定同位素(13C,
12、 15N)标记,(2) 蛋白质样品的准备,需要对白质分子进行稳定同位素(13C, 15N)标记 for protein of M. W. up to 20 kDa 50% 2H labeling 95% ul 15N labeling 98% ul 13C labeling 95% ul 15N, 98% ul 13C labeling for protein of M. W. 40 kDa or higher 50% 2H, 95% ul 15N, 98% ul 13C labeling,(3) 基本的多维NMR实验,Multi-dimensional NMR pulse program:
13、for backbone resonance assignments for side-chain resonance assignments for NOE measurements for J-coupling constant measurements for H/D exchange experiments for 15N relaxation experiments,三维异核实验脉冲程序: 用于氨基酸残基序列(主链)指认的脉冲程序 3D1H-15N-13C HNCA, HNCO, HN(CA)CO, HN(CO)CA, HN(CA)HA, HCACO, HCA(CO)N 用于氨基酸残
14、基的侧链指认的脉冲程序 3D1H-15N-13C CBCA(CO)NH, HNCACB, HBHA(CBCACO)NH, CC(CO)NH 3D1H-13C HCCH-COSY, HCCH-TOCSY,CBCA(CO)NH脉冲程序:顶部是磁化矢量传递路径,紧挨其下的I3, I2等对应于不同的磁性核。 = 10;= y;1 = y;2 = x, -x频率分辨(TPPI或者States-TPPI);3 = x;4 = x;5 = 2(x), 2(-x); rec = x, 2(-x), x。,(4) 三维NMR波谱分析,共振峰指认 共振谱峰分布范围 1H :10ppm;13C:185ppm;15N
15、:220ppm 两种指认策略:,三维异核波谱谱峰指认(基于J耦合的共振峰指认) : 首先完成氨基酸序列(主链)指认 然后进行氨基酸残基的侧链(自旋系统)指认,SNase的HNCA 谱,SNase 的HNCA和HNCO波谱,Ssh10b CBCA(CO)NH/HNCACB谱 K64-K68条带图。从左到右,每个残 基的CBCA(CO)NH和HNCACB谱图依次相邻。HNCACB谱上浅色的峰是 负峰。,Ssh10b HNCO/HN(CA)CO谱 K64-K68条带图。从左到右,每个残基的HNCO谱和HN(CA)CO谱依次相邻。,Ssh10b的HBHA(CO)NH和HBHANH实验,S79G82条带
16、图。从左到右, 每个残基的HBHA(CO)NH和HBHANH谱图依次相邻。标的是1H,标 的是1H。在谱上,1H和1H符号相反。,Ssh10b残基I76的CC(CO)NH和HCCH-TOCSY谱。 (A)CC(CO)NH实验的15N平面;(B)HCCH-TOCSY实验I76的侧链13C各个对应的1H-1H 平面。,NOE共振峰指认 1H-15N NOESY-HSQC,蛋白质中常见二级结构单元典型的NOE相关性,Characteristics of secondary structural elements,(1) - helix strong dNN (i, i+1) NOEs (contin
17、uous stretch) strong dN(i, i) and dN(i+1, i) NOEs medium dN(i, i+3) NOEs dNN(i, i+2) NOEs d(i, i+3) NOEs weak or absent dN(i, i+1) NOEs,(2) Anti-parallel pleated sheet strong NOEs: dN(i, i+1) medium NOEs: dNN(i-1, j+1) dNN(i+1, j-1) dN(i, j+1) dN(j, i+1) d(i, j) weak or absent NOEs: dNN(i, i+1),Anti
18、-parallel pleated sheet图例,(3) Parallel pleated sheet strong NOEs: dN(i, i+1) medium NOEs: dN(i, j) or dN(j, i) weak or absent NOEs: dNN(i, i+1) No d(i, j); dNN(i-1, j+1); dNN(i+1, j-1) NOEs,(4) Turns Reverse turn II: strong NOEs: dN(2, 3) & dNN(3, 4) weak NOEs: dN(1, 2) & dN(3, 4) some dN(i, i+2) &
19、dNN(i, i+2) NOEs require a Gly at position 3 small 3JN coupling constant,Reverse turn I: strong dNN(2, 3) & dNN(3, 4) NOEs weak dNN(1, 2), dN(2, 3) & dN(3, 4) NOEs some dN(i, i+2) & dNN(i, i+2) NOEs Half turn: strong dN(2, 3) & dN(3, 4) NOEs weak dN(1, 2) & dNN(3, 4) NOEs some dN(i, i+2) NOEs no dNN
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- 蛋白质 结构 功能 NMR 研究
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