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1、遗传与变异的概念,遗传和变异是生物体的最本质的属性之一。 遗传(heredity):亲代生物的性状在子代得到表现;亲代生物传递给子代一套实现与其相同形状的遗传信息。特点:具稳定性。 遗传型(genotype):又称基因型,指某一生物个体所含有的全部基因的总和;-是一种内在可能性或潜力。 遗传型 + 环境条件 表型 表型(phenotype):指生物体所具有的一切外表特征和内在特性的总和;-是一种现实存在,是具一定遗传型的生物在一定条件下所表现出的具体性状。,变异(variation):生物体在外因或内因的作用下,遗传物质的结构或数量发生改变。变异的特点:a.在群体中以极低的几率出现,(一般为1
2、0-610-10);b.形状变化的幅度大; c. 变化后形成的新性状是稳定的,可遗传的。 饰变(modification):指不涉及遗传物质结构改变而只发生在转录、转译水平上的表型变化。特点是:a.几乎整个群体中的每一个个体都发生同样的变化;b.性状变化的幅度小;c.因遗传物质不变,故饰变是不遗传的。引起饰变的因素消失后,表型即可恢复。,例如:粘质沙雷氏菌:在25下培养,产生深红色的灵杆菌素;在37下培养,不产生色素;如果重新将温度降到25,又恢复产色素的能力。,一、三个经典实验,1.经典转化实验:F.Griffith 研究对象:Streptococcus pneumoniae(肺炎双球菌)
3、SIII型菌株:有荚膜,菌落表面光滑,有致病性 RII型菌株:无荚膜,菌落表面粗糙,无致病性,1928年,Griffith进行了以下几组实验: (1)动物实验 对小鼠注射活RII菌或死SIII菌 小鼠存活 对小鼠注射活SIII菌小鼠死亡 对小鼠注射活RII菌和热死SIII菌 小鼠死亡 抽取心血 分离 活的SIII菌,(2)细菌培养实验,(3)S型菌的无细胞抽提液试验,以上实验说明:加热杀死的SIII型细菌细胞内可能存在一种转化物质,它能通过某种方式进入RII型细胞并使RII型细胞获得稳定的遗传性状,转变为SIII型细胞。,热死SIII菌不生长 活 RII 菌长出RII菌 热死SIII菌长出大量
4、RII菌和10-6SIII菌,活R菌+S菌无细胞抽提液长出大量R菌和少量S菌,+活RII菌,平皿培养,Griffith 转化试验示意,混合培养,RII型活菌,SIII型活菌,SIII型热死菌,RII型活菌,SIII型活菌,健康,健康,健康,健康,健康,健康,健康,病死,病死,病死,加S菌DNA 加S菌DNA及DNA酶以外的酶 加S菌的DNA和DNA酶 加S菌的RNA 加S菌的蛋白质 加S菌的荚膜多糖,活R菌,长出S菌,只有R菌,1944年O.T.Avery、C.M.MacLeod和M.McCarty从热死S型S.pneumoniae中提纯了可能作为转化因子的各种成分,并在离体条件下进行了转化试
5、验:,只有S型细菌的DNA才能将S.pneumoniae的R型转化为S型。且DNA纯度越高,转化效率也越高。说明S型菌株转移给R型菌株的,是遗传因子。,2.噬菌体感染实验,A. D. Hershey和M. Chase, 1952年,(1)含32P-DNA的一组:放射性85%在沉淀中,上清液中含 15%放射性,沉淀中含 85%放射性,沉淀中含 25%放射性,以35S标记蛋白质外壳做噬菌体感染实验,(2)含35S-蛋白质的一组:放射性75%在上清液中,上清液中含 75%放射性,生化提取分别获得含RNA的烟草花叶病毒蛋白质外壳(病毒1)和核酸(病毒2),抗血清处理,证明杂种病毒的蛋白质外壳来自病毒1
6、,而非病毒2,杂种病毒的后代的蛋白质外壳表现为病毒2,而非病毒1,遗传物质是核酸(RNA)而非蛋白质,3.植物病毒重建试验,1.核酸存在的七个水平及质粒 细胞水平:存在于细胞核或核质体,单核或多核 细胞核水平:原与真核生物的细胞核结构不同,核外DNA 染色体水平:倍性(真核)和染色体数 核酸水平:在原核中同染色体水平、存在部分二倍体DNA或RNA,复合或裸露,双链或单链 基因水平:具自主复制能力的遗传功能单位,长度与信息量,转录翻译 密码子水平:信息单位,起始和终止 核苷酸水平:突变或交换单位,四种碱基,二. 遗传物质在细胞内的存在部位和方式,2.染色体外遗传成份,基因不仅存在在染色体上,还存
7、在于细胞中的染色体外的遗传因子上,核外染色体,真核生物的“质粒” 原核生物的质粒,线粒体 细胞质基因 叶绿体 (质体) 中心体 动 体 共生生物: 卡巴颗粒 酵母菌的2m质粒,F因子 R因子 Col质粒 Ti质粒 巨大质粒 降解性质粒,原核微生物核外遗传物质,质粒(plasmid):,一种独立于染色体外,能进行自主复制的细胞质遗传因子, 主要存在于各种微生物细胞中。,(1)质粒的分子结构,通常以共价闭合环状(covalently closed circle,简称CCC)的 超螺旋双链DNA分子存在于细胞中;,也发现有线型双链DNA质粒和RNA质粒;,质粒分子的大小范围从1kb左右到1000kb
8、;(细菌质粒多在10kb以内),性质: 可以在细胞质中独立于染色体之外独立存在,也可以通过交换掺入染色体上,以附加体的形式存在; 质粒是一种复制子,根据自我复制能力的不同,可把质粒复制的控制形式分为严紧型和松弛型两种,严紧型质粒的复制受细胞核控制,与染色体DNA复制相伴随,一般一个寄主细胞内只有少数几个拷贝;松弛型质粒的复制不受细胞核控制,在染色体DNA复制停止的情况下仍可以进行复制,在细胞内的数量可以达到10200个或更多。 可以通过转化、转导或接合作用而由一个细菌细胞转移到另一个菌细胞中,使两个细胞都成为带有质粒的细胞;质粒转移时,它可以单独转移,也可以携带着染色体(片段)一起进行转移,所
9、以它可成为基因工程的载体。 对于细菌的生存并不是必要的 功能多样化,功能:进行细胞间接合,并带有一些基因,如产生毒素、抗药性、固氮、产生酶类、降解功能等。 重组:在质粒之间、质粒与染色体之间菌可发生。 存在范围:很多细菌如E.coli、Shigella、S.aureus、Streptococcus lactis、根癌土壤杆菌等 制备:包括增殖、裂解细胞、分离质粒与染色体和蛋白质等成分、去除RNA和蛋白质等步骤。 鉴定:电镜观察、电泳、密度梯度离心、限制性酶切图谱等方法,质粒的检测,提取所有胞内DNA后电镜观察,超速离心或琼脂糖凝胶电泳后观察,对于实验室常用菌,可用质粒所带的某些特点,如抗药性初
10、步判断。,对于由于三种构型同时存在时造成的多带现象(提取质粒时造成或自然存在),可以进行特异性单酶切,使其成为一条带。,特定的质粒提取方法和后处理使染色体和RNA均被除掉。,几种代表性质粒:,1. F因子(fertility factor):又称致育因子或性因子,62106Dalton,94.5kb,相当于核染色体DNA2%的环状双链DNA,足以编码94个中等大小多肽,其中1/3基因(tra区)与接合作用有关。存在于肠细菌属、假单胞菌属、嗜血杆菌、奈瑟氏球菌、链球菌等细菌中,决定性别。,最初发现于痢疾志贺氏菌中。 R因子由相连的两个DNA片段组成,即抗性转移因子(resistence tran
11、sfor factor, RTF )和抗性决定R因子(r-determinant),RTF为分子量约为11106Dalton,控制质粒copy数及复制,抗性决定质粒大小不固定,从几百万到100106Dalton以上。其上带有其它抗生素的抗性基因。 R因子在细胞内的copy数可从12个到几十个,分为严紧型和松弛型两种,经氯霉素处理后,松弛型质粒可达20003000个/细胞。,2. R因子(resistence factor),产大肠杆菌素因子。 大肠杆菌素是由E.coli的某些菌株所分泌的细菌素,能通过抑制复制、转录、转译或能量代谢等而专一地杀死其它肠道细菌。大肠杆菌素都是由Col因子编码的。
12、Col因子可分为两类,分别以ColE1和ColIb为代表。ColE1无接合作用,是多copy的;ColE1研究得很多,并被广泛地用于重组DNA的研究和用于体外复制系统上。ColIb与F因子相似,具有通过接合作用转移的功能,属于严紧型控制,只有12个copy。 凡带Col因子的菌株,由于质粒本身编码一种免疫蛋白,从而对大肠杆菌素有免疫作用,不受其伤害。,3. Col因子(colicinogenic factor),只在假单胞菌属中发现。它们的降解性质粒可为一系列能降解复杂物质的酶编码,从而能利用一般细菌所难以分解的物质做碳源。这些质粒以其所分解的底物命名,例如有分解CAM(樟脑)质粒,XYL(二
13、甲苯)质粒,SAL(水杨酸)质粒,MDL(扁桃酸)质粒,NAP(奈)质粒和TOL(甲苯)质粒等。,4. 降解性质粒,即诱癌质粒。存在于根癌土壤杆菌中,可引起许多双子叶植物的根癌。 当细菌侵入植物细胞中后,在其细胞中溶解,把细菌的DNA释放到植物细胞中。这时,含有复制基因的Ti质粒的小片段与植物细胞中的核染色体发生整合,破坏控制细胞分裂的激素调节系统,从而使它转变成癌细胞。 Ti质粒长200kb,是一个大型质粒。当前,Ti质粒已成为植物遗传工程研究中的重要载体。一些具有重要性状的外源基因可借DNA重组技术设法插入到Ti质粒中,并进一步使之整合到植物染色体上,以改变该植物的遗传性,达到培育植物优良
14、品种的目的。,5. Ti质粒(tumor inducing plasmid),是近年来在Rhizobium(根瘤菌属)中发现的一种质粒,分子量为200300106Dalton,比一般质粒大几十倍到几百倍,故称巨大质粒,其上有一系列固氮基因。,6. 巨大质粒(mega质粒),突变( mutation ):指生物体的表型突然发生的可遗传的变化。 染色体畸变细胞学上可以看到染色体的变化 突变 基因突变细胞学上看不到遗传物质的变化 突变体(mutant):发生了突变的微生物细胞或菌株 野生型(wild type):从自然界分离到的任何微生物在其发生突变前的原始菌株,第二节 基因突变和诱变育种,依表型的
15、改变分为: 形态突变型 营养缺陷型因突变而丧失产生某种生物合成酶的能力,并因而成为必须在培养基中添加某种物质才能生长的突变类型。 发酵突变型丧失产生某种生物合成酶能力的突变型 抗性突变型因突变而产生了对某种化学药物或致死物理因子的抗性 条件致死突变型突变后在某种条件下可正常生长繁殖,而在另一条件下却无法生长繁殖的突变型 抗原突变型因突变而引起的抗原结构发生改变 产量突变型,基因突变的类型,按是否比较容易、迅速地分离到发生突变的细胞来分: 选择性突变株(selective mutant):具有选择标记(如营养缺陷性、抗性突变型、条件致死突变型),只要选择适当的环境条件,如培养基、温度、pH值等,
16、就比较容易检出和分离到。 非选择性突变株(non-selective mutant):无选择标记(如产量突变型、抗原突变型、形态突变型),能鉴别这种突变体的惟一方法是检查大量菌落并找出差异。,定义:每一细胞在每一世代中发生某一性状突变的几率。 突变率为108是指该细胞在一亿次细胞分裂中,会发生一次突变。突变率也可以用每一单位群体在每一世代中产生突变株(mutant,即突变型)的数目来表示。如一个含108个细胞的群体,当其分裂为2108个细胞时,即可平均发生一次突变的突变率也是108 。 突变率=突变细胞数/分裂前群体细胞数 突变是独立的。某一基因发生突变不会影响其它基因的突变率。在同一个细胞中
17、同时发生两个基因突变的几率是极低的,因为双重突变型的几率只是各个突变几率的乘积。 由于突变的几率一般都极低,因此,必须采用检出选择性突变株的手段,尤其是采用检出营养缺陷型的恢复突变株(back mutant或reverse mutant)或抗性突变株特别是抗药性突变株的方法来加以确定。,突变率,菌 名 突变性状 突变率 E. coli 抗T1噬菌体 3 108 E. coli 抗T3噬菌体 1 107 E. coli 不发酵乳糖 1 1010 E. coli 抗紫外线 1 105 Staphylococcus aureus 抗青霉素 1 107 S. aureus 抗链霉素 1 109 Sal
18、monella typhi 抗25g/L链霉素 1 106 Bacillus megaterium 抗异烟肼 5 105,若干细菌某一性状的自发突变率,基因突变的自发性和不对应性的证明,在各种基因突变中,抗性突变最为常见。但在过去相当长时间内对这种抗性产生的原因争论十分激烈。 一种观点认为,突变是通过适应而发生的,即各种抗性是由其环境(指其中所含的抵抗对象)诱发出来的,突变的原因和突变的性状间是相对应的,并认为这就是“定向变异”,也有人称它为“驯化”或“驯养”。 另一种看法则认为,基因突变是自发的,且与环境是不相对的。由于其中有自发突变、诱发突变、诱变剂与选择条件等多种因素错综在一起,所以难以
19、探究问题的实质。 从1943年起,经过几个严密而巧妙的实验设计,主要攻克了检出在接触抗性因子前已产生的自发突变株的难题,终于解决了这场纷争。,变量试验又称波动试验或彷徨试验。 1943年,S. E. Luria 和M. Delbrck 根据统计学原理,设计了左方的实验。,1. 变量试验,涂布试验中突变率的计算,初始接种量:5 104 个/皿 培养5小时,繁殖了12.3代,每个微菌落约含5100个细菌 这时,每个平皿上的细胞数为: 5100 5 104 2.6 108个/皿 在6个平板上,比接种时增加的细胞数为: 6 (2.6 108 5 104)= 15.6 108 在未涂布的平板上共发现28
20、个突变,故 突变率 = 28/15.6 108 = 1.8 108,3. 平板影印培养试验,1952年,J. Lederberg夫妇的论文平板影印培养法和细菌突变株的间接选择,更好地证明了微生物的抗药性是在未接触药物前自发产生的,这一突变与相应药物环境毫不相干。 平板影印培养法,是一种能达到在一系列培养皿的相同位置上出现相同遗传型菌落的接种培养方法:把长有许多菌落的母种培养皿倒置于包有灭菌丝绒布的木质圆柱印章上,使其沾上来自平板上的菌落。然后可把这一“印章”上的菌落一一接种到不同的选择性培养基平板上。待这些平板培养后,对各平板相同位置上的菌落作对比后,就可选出适当的突变型菌株。据报道,用此法可
21、把母平板上1020%量的细菌转移到丝绒布上,并可利用这一“印章”接种8个子培养皿。因此,通过影印培养法,就可以从在非选择性条件下生长的细菌群体中,分离出各种类型的突变株。,平板影印培养法,在根本未接触过任何一点链霉素的情况下,就可以筛选到大量抗链霉素的突变株,充分说明了突变是自发产生的,链霉素只是起到了一种检出作用。平板影印培养不仅在微生物遗传理论的研究中有重要应用,而且在育种时间和其它研究中均有应用,值得很好地领会。,基因突变的机制,基因突变的原因是多种多样的,可以是自发的或诱发的,诱变又可分为点突变和畸变。具体类型可归纳如下:,二、突变与育种 (一)自发突变与育种: 选育 定向培育 (二)
22、诱变育种 1、诱变育种的基本环节,2、诱变育种的原则 (1)使用简便有效的诱变剂,诱变剂,物理因素,化学因素,紫外线 激光 离子束 X射线 r射线 快中子,烷化剂 碱基类似物 吖啶化合物,Ames试验:利用细菌模型了解潜在化学致癌物的诱变作用,“生物化学统一性”法则: 人和细菌在DNA的结构及特性方面是一致的,能使微生物发生突变的诱变剂必然 也会作用于人的DNA,使其发生突变,最后造成癌变或其他不良的后果。,诱变剂的共性原则: 化学药剂对细菌的诱变率与其对动物的致癌性成正比 超过95%的致癌物质对微生物有诱变作用 90%以上的非致癌物质对微生物没有诱变作用,美国加利福尼亚大学的Bruce Am
23、es教授于1966年发明,因此称为Ames试验 具体操作:检测鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhmurium)组氨酸营养缺陷型菌株(his-)的回复突变率 回复突变:突变体失去的野生型性状,可以通过第二次突变得到恢复,这种第二次突变称为回复突变,证明Ames试验重要性的应用实例: 国外曾开发了一种降低妇女妊娠反应的药物“反应停”,由于其药效显著,在60-70年代十分流行, 但随后人们就发现畸形儿的出生率明显增高,而且生产畸形儿的妇女大多曾服用“反应停”,后来采用Ames试验发现这种物质的确具有很强的致突变作用,因此这种药物被禁止使用 但如果能在这种药物上市之前就进行Ames试验检测,那么这种大量出生畸形儿的悲剧完全可以避免,,(2)选用优良的出发菌株 (3)处理单细胞或单孢子悬浮液 (4)使用最佳诱变剂量 剂量 = 强度(浓度) 作用时间 相对剂量 = 杀菌率 (5)利用协同效应 (6)寻找和利用形态、生理与产量间的相关指标 (7)设计高效率筛选方案 (8)根据具体情况创造新型筛选方案,3、突变株的筛选:(1)产量突变株的筛选 (2)抗药性突变株的筛选 (3)营养缺陷型突变株的筛选,突变株的筛选方法,诱变,检出营养缺陷型,淘汰野生型,鉴定营养缺陷型,富集培养 (抗生素法) (菌丝过滤法),夹层培养法 限量补充培养法 逐个检出法 影印平板法,生长谱法,
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