遗传修饰动物模型.ppt
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1、 第十三章 遗传修饰动物模型 Date1 第一节转基因动物的概念及其发展简史 转基因动物(transgenic animal): 是指基因组中整合有外源基因、外源基因 能够表达并按孟德尔定律遗传的一类动物 。 转基因(transgene): 将外源基因整合入动物基因组中的操作。 嵌合体动物(chimera): 部分组织中整合有外源基因的动物。 Date2 第一节转基因动物的概念及其发展简史 转基因的三个层次: 细菌转基因 离体真核细胞转基因 生物转基因 Date3 第一节转基因动物的概念及其发展简史 人类疾病动物模型(Animal models of human diseases)是指在医学研
2、究中,在动物 身上建立,或形成类似人类疾病动物。通过动 物模型直接,或间接反映疾病的发生和发展过 程,在了解疾病的基础上开创和改进、优化疾 病的治疗。 Date4 第一节转基因动物的概念及其发展简史 转基因技术是在基因工程和胚胎工程的基础 上发展起来的 1961年,Tarkowski等将小鼠卵裂期不同品系 的胚胎细胞融合后,形成了嵌合体小鼠; 1974年,Jaenisch和Mintz将SV40DNA注射入 小鼠囊胚中,在小鼠的体细胞检测到病毒 DNA序列; 1980年,Gordon首次将重组的DNA注射到 小鼠体细胞中; Date5 第一节转基因动物的概念及其发展简史 1982年,Palmit
3、er将金属巯基(MTI)基因启 动子控制的大鼠生长激素基因转入侏儒小 鼠的受精卵,得到的7只转基因鼠中,有6 只生长明显加快,体重远大于正常对照, 被称为“超级小鼠”(Supermice)。 82年以后,转基因技术得到了大力的推广 和研究,至今已制备出小鼠、大鼠、鸡、 兔、猪、羊、鱼等转基因品系。 Date6 1、第一例嵌合体小鼠 1974年最早把猿猴病毒40(SV40)注入小鼠囊胚腔中得到部分组 织中含有SV40DNA的嵌合体小鼠。但无任何表型改变。 2、第一个转基因小鼠系 1976年建立了世界上第一个转基因小鼠系,这些小鼠基因 组中插人了莫氏白血病病毒基因。他们是运用反转录病毒与小 鼠卵裂
4、球共培养把外源DNA插入到小鼠的基因组中。 3、第一例显微注射法产生转基因小鼠 1980年,Gordn等把SV40DNA显微注射到小鼠受精卵的原核 中,获得了两只转基因小鼠,创建了显微注射转基因方法。 Date7 4、“超级鼠” 1982年,Palmiter和 Brinster用此方法把大鼠的生长激素基因 导入小鼠受精卵,获得了成年体重是对照 组小鼠2倍的“超级鼠”,首先证明外源基 因可在受体中表达,并且表达产物具有生 物活性。 5、转基因家畜的产生转基因家兔、绵羊和 猪(Hammer等,1985)、牛(Bondioli等, 1988)和山羊(Ebert等,1991)等相继出世 。 Date8
5、 Date9 Date10 6、利用转基因生产重组蛋白 1987年,Simons等在转基因小鼠的乳汁中得到绵羊的 -球蛋白,1988年,该研究小组又从转基因绵羊的乳汁中 得到了-抗胰蛋白酶。目前,已有数十种蛋白实现了转 基因生产。 7、转YAC的转基因小鼠 近10年内,陆续出现用全长酵母人工染色体(YAC)DNA 来产生转基因小鼠。 Date11 东北农业大学国内首例绿色荧光蛋白“转基因 ”克隆猪 绿色荧光蛋白猪胎儿成纤维细胞克隆 Date12 1987年,世界上第一只商业化转基因绵羊 在英国著名的罗斯林研究所诞生。转基因 母羊的乳汁中可以分泌-抗胰蛋白酶。 Date13 2010年,FDA批
6、准转基因鲑鱼 Date14 转基因动物的意义: 基因的整体功能的阐明只有在活体内通过 整体动物的研究才能达到; 转基因动物是生物医学研究、新药开发、 毒理学、安全性评价的重要工具。 转基因动物用途: (l)疾病型转基因动物;(2)利用转基 因动物制药;(3)动物改良型;(4)基 础生物学研究 第一节转基因动物的概念及其发展简史 Date15 (l)疾病型转基因动物 替代: 避免了人体实验造成的风险和伦理问题。 潜伏期长,病程长和发病率低的疾病 可控: 品系,感染病原体 实验环境 方便: 样品收集 结果分析容易(统计); 人畜共患病比较,研究疾病机理 Date16 (2)利用转基因动物制药: 生
7、物反应器重组蛋白药物 欧洲医药评价署人用医药产品委员会 2006年6月2日首次 批准了用转基因山羊奶研制而成的抗血栓药物Atryn(抗 凝血酶)上市 目前世界上还有利用转基因绵羊、牛和兔乳腺生物反应器 生产的人-抗胰蛋白酶(抗蛋白酶缺乏性肺气肿药物)、 重组组织血纤维蛋白溶酶原激活剂(抗栓药)和人C1抑 制剂(治疗血管神经性水肿的药物)等重组蛋白药物也已 经完成或进入临床期试验,特别是治疗性抗体药物,发 展潜力更大。 Date17 目前已在下列动物的乳汁中生产出一些人类蛋白质药 物: 牛:抗凝血酶、纤维蛋白原、人血清白蛋白、胶原蛋 白、乳铁蛋白、糖基转移酶、蛋白C等; 山羊:抗凝血酶原、抗胰蛋
8、白酶、血清白蛋白、组织 纤溶原激活因子、单克隆抗体等; 绵羊:抗胰蛋白酶、凝血因子、蛋白C; 猪:凝血因子、蛋白C、纤维蛋白原、血红蛋白。 Date18 第二节 研制转基因动物的基本步骤 1.转基因载体的构建 2.将外源基因引入受体胚胎 3.通过胚胎移植和基因型鉴定获得携带 外源基因的转基因动物 4.通过转基因动物的表型分析研究外源 基因的功能 Date19 第二节 研制转基因动物的基本步骤 基本原理 将改建后的目的基因用显微注 射等方法注入实验动物的受精卵,然 后将此受精卵再植入受体动物的输卵 管中,使其发育成携带有外源基因的 转基因动物,人们可以通过转入外源 基因培育优良品种的工程动物等。
9、 Date20 目的基因的分离与克隆 表达载体构建 卵母细胞的收集 体外成熟培养 基因导入 转基因胚胎的获得 获得子代动物 转基因胚胎的移植 转基因整合表达的检测 获得转基因动物 受体动物的选择 Date21 构建转基因载体 含有外源目的基因的重组载 体导入受体胚胎 转基因胚胎的发育及鉴定 通过转基因动物表型分析研究外源基因的功能 Date22 转基因动物的技术路线 经典的技术路线 目的基因 显微注射 已交配的 受体动物 供体动物 输卵管 转基因动物 取出 移植 妊娠 缺点: 注入目的基因的命中率低,目的基因的整 合率低,受精卵移植的受孕率低。 受精卵 Date23 转基因动物的技术路线(续)
10、 整合胚胎移植的技术路线 转基因动物 受体动物子宫 目的基因 非手术 胚胎移植 体外受精 体外培养 检测 卵子 受精卵 多细胞胚胎 整合外源基因 精子 或囊胚 的胚胎 优点: 受精卵的成活率高达90以上,外源基因整合率高, 提高受孕率。 Date24 转基因动物的技术路线(续) 整合卵受精的技术路线: 目的基因 转基因动物 导入 逆转录病毒 妊娠 精子 感染 体外受精 胚胎移植 卵母细胞 成熟卵细胞 囊胚 受体动物子宫 特点:卵母细胞导入目的基因后再与精子受精。 Date25 转基因动物的技术路线(续) 核移植(克隆)的技术路线 目的基因 转基因动物 导入 动物胚胎成纤维细胞 妊娠 取核 动物
11、 重组的 囊胚期 受体动物 卵细胞 受精卵 胚胎 子宫 去核 体外培养 胚胎移植 特点:体细胞核移植;核移植前导入目的基因。 Date26 表达调控元件目的基因 报告基因 如果观察外源基因表达所引起的生物学效 应,可选择表达水平高而无组织特异性的 强启动子,如CMV、pGK等; 如果希望观察外源基因在特定组织器官中 的功能,应选用组织特异性启动子,如肝 蛋白启动子、胰岛素启动子等; 可诱导型启动子调控外源基因的表达。 Date27 1.外源目的基因的分离 2.外源目的基因与转性基因表达启动子、增 强子、报告基因等构件的拼接重组 3.重组DNA导入生殖细胞或胚胎干细胞 4.胚胎移植技术 5.鉴定
12、及筛选 6.目的基因整合率及表达效率的检测 转基因动物的关键技术包括 Date28 第二节 研制转基因动物的基本步骤 转基因载体的构建及制备 转基因载体的要求: 启动子 目的基因 报告基因 多聚腺苷酸化信号 绝缘子 Date29 第二节 研制转基因动物的基本步骤 启动子: 组成型启动子 组织特异型启动子 诱导型启动子 诱导型组织特异型启动子 Date30 第二节 研制转基因动物的基本步骤 Kozak序列(ACCAUGG): 核糖体能够识别mRNA上的这段序列,并把 它作为翻译起始位点。注意这段序列并不是 ribosomal binding site (RBS)核糖体结合位点 ,而是帽子结构。
13、真核生物基因中起始密码子上下游的最佳序 列为,-3位为嘌呤碱基;+4位为G,起始密 码子AUG中的A处于+1位。A/GCCAUGG被 称为kozak序列或扫描序列。 Date31 第二节 研制转基因动物的基本步骤 KOZAK是一个女科学家,她研究过起始密 码子AUG周边碱基定点突变后对转录和翻 译所造成的影响,并总结出在真核生物中 ,起始密码子两端序列为: G/N-C/N- C/N-ANNAUGG,如GCCACCAUGG 、GCCAUGAUGG时,转录和翻译效率最 高,特别是-3位的A对翻译效率非常重要。 该序列被后人称为Kozak序列,并被应用于 表达载体的构建中。 Date32 第二节 研
14、制转基因动物的基本步骤 Kozak规则,即第一个AUG侧翼序列的碱 基分布所满足的统计规律,若将第一个 AUG中的碱基A,U,G分别标为1,2,3 位,则Kozak规则可描述如下: (1)第4位的偏好碱基为G; (2)AUG的5端约15bp范围的侧翼序列内 不含碱基T; (3)在-3,-6和-9位置,G是偏好碱基; (4)除-3,-6和-9位,在整个侧翼序列区,C 是偏好碱基。 Date33 Date34 第二节 研制转基因动物的基本步骤 绝缘子:在基因组内建立独立的转录活性 结构域的边界DNA序列称为绝缘子/隔离子 (insulator)。绝缘子能够阻止邻近的增强 子或沉默子对其界定的基因的
15、启动子发挥 调控作用。 Date35 绝缘子元件阻断邻近增强子的活性 Date36 第二节 研制转基因动物的基本步骤 目的基因 以往构件目的基因时一般使用基因文 库中的cDNA序列,实践证明仅有 cDNA序列往往难以得到有效表达, 至少一个内含子与cDNA序列结合会 使基因得到更好的表达,常使用基因 组DNA。 Date37 第二节 研制转基因动物的基本步骤 报告基因 是一种编码可被检测的蛋白质或酶的 基因,也就是说,是一个其表达产物 非常容易被鉴定的基因。 常用LacZ、 EGFP等便于观察 多聚腺苷酸化信号 Date38 Date39 Date40 Date41 第二节 研制转基因动物的基
16、本步骤 转基因的方法: 1、受精卵雄原核显微注射法(最常用) 2、胚胎干细胞(ES)法 3、逆转录病毒法 4、体细胞核移植法 5、精子载体法 6、YAC法 Date42 第二节 研制转基因动物的基本步骤 转基因常用细胞: 1)受精卵:受精卵基因操作注射 假孕动物子宫胚胎个体。 2) 胚胎干细胞:从着床前的动物胚 胎中分离多功能胚胎干细胞 基因操 作注射入动物囊胚形成嵌合体胚 胎嵌合个体。 Date43 第二节 研制转基因动物的基本步骤 受精卵雄原核显微注射法: 以单细胞受精卵为靶细胞,利用显微 注射技术将构建好的载体DNA直接注 射入受精卵的雄原核,再将接受注射 的受精卵移入假孕母体输卵管继续
17、发 育获得转基因动物个体。 Date44 Date45 Date46 Date47 第二节 研制转基因动物的基本步骤 载体DNA制备 胚胎操作过程 受精卵准备 显微注射 假孕母鼠准备(养母) 胚胎移植 对幼鼠鉴定 Date48 第二节 研制转基因动物的基本步骤 目的基因可以来源于: 通过限制性内切酶预先分离的某一基因。 逆转录法得到的cDNA。 人工合成的DNA片段。 聚合酶链式反应(PCR)扩增的特定基因 片段。 Date49 第二节 研制转基因动物的基本步骤 目的基因的克隆可以通过载体方式进 行,通常选择质粒作为载体。将目的 基因与质粒结合形成重组因子,然后 转化至大肠杆菌,扩增质粒,再分
18、离 纯化重组质粒DNA,用适当的限制性 内切酶消化,制备成线状基因片段备 用。 Date50 第二节 研制转基因动物的基本步骤 胚胎操作过程 卵供体母鼠和假孕母鼠的准备 定期准 备相当数量的卵供体母鼠和假孕母鼠 以及一批相对稳定的正常公鼠与结扎 公鼠。这些鼠的有关要求如下表 Date51 第二节 研制转基因动物的基本步骤 超排卵与取卵 选择46周龄母鼠,注 射孕马血清促性腺激素(PMSG)后, 隔4248h再注射人绒毛膜促性腺激素 (HCG),注射HCG后1013h剖腹取 卵,用培养液保存,置CO2培养箱备用 。 Date52 第二节 研制转基因动物的基本步骤 基因显微注射 用专门的持卵管和注
19、 射针,在显微注射仪上操作,将纯化 的目的基因(DNA)注射到受精卵 的雄性原核内。 Date53 operation panel holding pipette microneedle. eye lens Date54 显微注射法 显微注射法是在显微注射仪上,一侧用 吸管固定受精卵,另一侧将注射针插入受精 卵原核(一般是雄原核)。拔出显微注射针 解除固定管的负压,操作完成。 Date55 Date56 第二节 研制转基因动物的基本步骤 受精卵移植 转基因受精卵在单细胞至 桑椹胚阶段移植到受孕后0.5d的假孕 母鼠的输卵管,在囊胚期则移植到受 孕后2.5d的假孕母鼠子宫。每只假孕 母鼠移植20
20、30个转基因卵为宜。 Date57 X 1-cell pronuclear stage mouse embryo. PMS + HCG to superovulate Pregnant Foster Mother Oviduct Transfer + + 2-cell stage embryo Holding Pipette Injection Pipette Date58 Events During Transgenesis DAY Fertilization 12 AM12 AM12 AM12 AM12 AM12 AM12 AM Reimplantation Mating Microinj
21、ection Cell Division Gestation Birth Embryo Recovery E1E2E21 12345 hCGPMS Date59 1.结扎公鼠的制备 为了获得同步发情的假孕母鼠,要 准备结扎公鼠,通常选用5周龄公鼠做手 术,分笼饲养,每笼一只。术后23周 即完全康复,可用其生产假孕母鼠。 目的:为了产生同期发情的母鼠 第二节 研制转基因动物的基本步骤 Date60 Date61 2.超数排卵 供体母鼠(不动情的25g母鼠)腹腔注 射PMSG 10U(马血清促性腺激素), 一般选择在中午注射,间隔48小时后注 射HCG(人绒毛膜促性腺激素),光照 周期保持1214
22、h; 第二节 研制转基因动物的基本步骤 Date62 Date63 3.同期发情 将注射HCG后的母鼠与正常公鼠合笼, 并于第二天早上检查阴道栓,如果见栓 说明已经配上种了,计做怀孕0天。 受体母鼠(普通发情母鼠)与结扎公鼠合 笼,第二天早上检查阴道栓,有栓的母 鼠可用于胚胎移植(假孕母鼠)。 第二节 研制转基因动物的基本步骤 Date64 Date65 计算时间 与结扎公鼠 Date66 4.胚胎收集和预处理 (1)受精卵的收集和处理 见栓当日的胚胎处于1细胞期。 以脱颈椎法杀死母鼠,暴露子宫、输卵 管;剪下子宫、输卵管,并置于平皿中 ;在灭菌平皿中剪下输卵管置入盛有冲 卵液的集卵杯中,在体
23、视显微镜下撕开 壶腹部,释放受精卵并用新鲜的培养液 洗12次。 第二节 研制转基因动物的基本步骤 Date67 Date68 Date69 用透明质酸酶处理受精卵细胞团 Date70 Date71 (2)28细胞胚胎的收集 交配后2060小时,输卵管中存在有28 细胞期胚胎。此时卵丘细胞已经脱掉,可用 1ml的注射器自输卵管伞口冲得胚胎。其基本 步骤如下:取输卵管,在体视显微镜下找到输 卵管伞口,伞口呈平截状,周边略显粗糙。然 后,用镊子轻轻夹住伞口下部位,慢慢将冲卵 针插入伞口,再用镊子轻轻夹住针头,推压注 射器,胚胎从另一端冲出。洗涤胚胎:收集冲 得的胚胎,用新鲜的培养液洗12次,转入培
24、养过程。 第二节 研制转基因动物的基本步骤 冲卵 Date72 5.胚胎移植 (1)输卵管移植 根据胚胎数,确定供胚胎移植 的受体母鼠数,并做好手术准备。 手术切口位于两侧腰部距背正中线1 cm处,左右各一个相互平行的切口 。 第二节 研制转基因动物的基本步骤 Date73 Date74 小鼠麻醉、剪毛、消毒后,用手术剪 切开小鼠的皮肤、肌肉、打开腹腔 ,暴露卵巢、卵巢脂肪垫,并用镊 子夹住脂肪组织,把卵巢、输卵管 和一部分子宫角慢慢拉出,通过用 纱布保护的切口置于纱布上。 第二节 研制转基因动物的基本步骤 Date75 Date76 Date77 在体视显微镜下观察输卵管伞,并用 移卵管吸取
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