遗传学第七章2012.ppt
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1、第七章 细菌和病毒的遗传 细菌和病毒都是低等生物,在遗传研究中作用很大,是现代遗传学研究基因结构与表达的好材料,也是遗传工程直接的操作对象。,1细菌和病毒研究的遗传意义 一、细菌(germ) 细菌属原核生物,体积小,结构简单,有核物质没有核结构,并且大多数细菌的染色体是裸露的DNA分子,没有蛋白质结合。如大肠杆菌(Escherichia Coli 通常缩写为E. Coli)在现代遗传学和微生物遗传学的研究中应用广泛,是基因克隆的最好工具。,大肠杆菌的DNA以单个主染色体的形式出现,其分子长约1100m,分子量约2.6109。这种DNA不与组蛋白结合,也不形成核小体,是一个封闭的大环,没有起点和
2、终点。除了主染色体之外,细胞里通常还具有一个或多个小染色体,人们通常把小染色体叫质粒,也是一个小环,也不与组蛋白结合。,细菌培养有两种方法:一是液体培养基培养,二是固体表面培养基培养(琼脂)。在适当条件下培养,20分钟可繁殖一代,一昼夜便可达到肉眼能看得见的菌落 (107个细菌)。,细菌的突变型: 1营养缺陷型:野生型(即原养型)在基本培养基中能合成所需要的各种物质,某基因突变以后,就成为营养缺陷型(突变型),营养缺陷型为致死突变,在基本培养基中必须添加缺陷的营养物质才能存活,这类基因命名一般取前3个字母,原养型在字母后加上标“”,突变型不加或加“”。,2分解代谢功能突变型:野生型的能将一些较
3、复杂的营养物质分解,如乳糖、氨基酸、脂肪酸等,担负这些功能的基因发生突变以后,就会丧失分解这些物质的能力。,3抗性突变型:野生型的对一些抗菌素或噬菌体(bacteriophage,通常缩写为phage)敏感,有关基因突变后,就成为抗某种抗菌素或某种噬菌品系,成抗性突变型,在培养基中添加某种抗菌素或某种噬菌能把野生型的杀死,但不能杀死抗性突变型。,莱德伯格(Ledeberg,J)等人设计的印影培养法就是鉴定突变的一种方法:先将待测的细菌在母板培养基上培养成菌落,母板上采用完全培养基,也不添加抗菌素和phage,突变型和野生型均可繁殖,菌落培养成以后,用一 块比培养基略小的木板,包上一层严格消毒的
4、丝绒布,印在母板菌上, 母板上的细菌吸附在丝绒布上,再 把这块包着丝绒的木板分别印在各 种不同的添加培养基因 上,分析各 培养基上菌落的形成,在缺乏某种 物质的培养基上不能形成菌落,或 者添加某种phage能生长,即为某 种缺陷型或抗某phage的突变型。,如,链霉素抗性突变性的筛选,二、病毒 病毒不具有细胞结构,体积很小,但也有遗传物质,也可以繁殖后代。病毒是靠寄生生活,根据宿主的类型又分为三种病毒:植物病毒、动物病毒和细菌病毒类。噬菌体(phage) 是细菌病毒。 目前人们对 phage了解 较多,phage 的遗传物质 分子结构, 又分为 单链DNA、 单链RNA、 双链DNA 和双链R
5、NA。,三、细菌和病毒在遗传研究中的优越性 1世代周期短:细菌在适宜的温度下20min可繁 殖一代,病毒更快,不到 10min便可繁殖一代。 2便于管理和生化分析 :个体小,一般在 1m 至几m之间,操作管理方便。 3便于研究基因的突变 :裸露的DNA分子(有的病毒为RNA分子),易受环境条 件的影响而发生突变;单倍体生物,不存在显性掩盖隐 性问题,显隐性突变均能表现出来。 4便于研究基因的作用 :影印培养,易检出营养缺陷型突变,有利于从生化 角度来研究基因的作用。 5便于研究基因重组 :细菌具有转化、转导和接合作用,可以进行精密的遗 传学分析。 6便于研究基因结构、功能及调控机制 :细菌和病
6、毒的遗传物质简单,易于 进行基因定位、结构分析和分离,基因的表达调控也 适于采用生理生化的方法进行深入研究。 7便于进行遗传操作 :染色体结构简单,没有组蛋白和其它蛋白的结合,更 宜于进行遗传工程的操作。,2. 噬菌体的遗传分析 一、噬菌体的结构 噬菌体是一种细菌病毒,结构非简单,遗传学研究中应用最多是T噬菌体系列,通常应用T1T7。它们的结构大同小异,外貌似蝌蚪。 (P153,图7-4)T偶列噬菌体(T2、T4、T6)头部呈六角形,为蛋白质外壳和内含的DNA双链分 子,头下的尾部包括一个 中空的针状结构及外鞘, 末端是基板,由尾丝及 尾针组成,T偶列噬菌体 将尾丝附着在E. Coli的 表面
7、,通过尾鞘的收缩 将噬菌体的DNA注入 到E. Coli细胞中。,噬菌体DNA注入细胞以后,对宿主细胞的影响不同,通常分为两类: 1烈性噬菌体:DNA注入宿主以后,快速复制,组装成许多新的子噬菌体,并使细胞裂解,将噬菌体释放出来,再重新侵染E. Coli细胞,这种途径称为裂解途径。,2温和性噬菌性:温和性噬菌体具有溶源性,即不使宿主的细胞裂解,形成共生状态,随着宿主细胞染色体的复制而复制,分裂而分裂,能够相安共存,一个子细胞中有一份噬菌体拷贝,这种途径称为溶源途径。 温和性噬菌体又有两种类型: 噬菌体;P噬菌体。,-phage侵入宿主细胞以后,细菌不裂解 附在E.coli染色体上的gal(半乳
8、糖)和bio(生物素)位点间的att座位上 通过交换整合到细菌染色体上,并能阻止其它噬菌体的超数感染。,P1-phage代表P类噬菌体, 这类噬菌体的DNA进入 宿主细胞以后不整合到 宿主细胞的染色体上, 独立存在和宿主共生。,这两类噬菌体的共同特点是不大量复制、转录和翻译,这类噬菌体往往只有一个或少数几个基因表达,产生阻遏物,使其它基因被关闭不能表达。 -phage通过一些 诱导因素如紫外线(UV)、 温度改变、烈性噬菌体的 诱导,可使关闭的基因 表达,成为烈性噬菌体, 进入裂解途径。,二、T2噬菌体的基因重组与作图 赫尔歇将他研究的phage性状分为两类: 1侵染E. Coli细胞时,细胞
9、裂解形成噬菌 斑的形态,如斑的大小、斑的边缘清晰或 模糊。 2为宿主细胞的反应,如宿主细胞的抗裂 解能力的不同基因型有不同的表现型。,T2-phage侵染E. Coli时: T2-phage的性状: 野生型: r噬菌斑小而边缘模糊 突变型: r噬菌斑大而边缘清晰 E. Coli的性状: B株突变B/2株抗T2-phage phage 野生型h:能侵染E. Coli B株,不能侵染B/2株 突变型h:能侵染E. Coli B株和B/2株两种 h r+ 噬菌斑小, 能侵B株和B/2株 hr 噬菌斑大,只能侵染B株 将两种phage杂交,将这两种phage双重侵染E. Coli B株(不能一先一后,
10、必须是同时),这两种phage亲本的DNA分子在宿主细胞内重组:可以形成四种基因型的phage,接种在B株和B/2株混合培养基中,,表现为: hr 半透明 大噬菌斑 亲本类型 hr 透明 小噬菌斑 hr 半透明 小噬菌斑 重组类型 hr 透明 大噬菌斑 将观察结果记录下来,计算重组值: 重组值去掉百分号即为cM,为这两个基因的遗传距离。,这种方法也可以采用另一个类似的过程,叫转染(trancfection),经过特殊处理的细菌细胞可以直接吸收裸露的DNA分子,不同的DNA分子在宿主细胞中同样也可以复制和重组,也可以计算RF值。,例 溶菌性噬菌体控制溶菌速度的有三个基因,分别为 、 、 ,这三个
11、基因突变型 、 、 的溶菌速度不同,可以分别测得这三个基因与h基因的距离。(见P155表7-2),由表7-2可知:rah之间 RF=24% rbh之间 RF=12.3% rch之间 RF=1.6% 那么, 这四个基因在环状染色体上可以有四种排列方式(P155下) 是哪一种排列方式,还必须通过进一步的实验来确定,可先考虑三个基因:rb、rc及h的排列顺序:是rchrb还是hrcrb,为此需作 ,求得RF值。 如 RFb.c = RFh.b + RFh.c 为 rb h rc RFb.c = RFh.b RFh.c 则为 h rb rc 在这里实际测得RFb.c = RFh.b + RFh.c h
12、 应位于rb及rc之间,排列顺序 rchrb。 那么ra在h基因的左或是右,答案是都可以,因为是环状的染色体。 (见P156图7-8),ra,rb,rc,h,h,h,24,12.3,1.6,ra,ra,ra,ra,h,h,h,h,rb,rb,rb,rb,rc,rc,rc,rc,三、-phage的基因重组与作图 和高等动、植物一样,phage也可以进行三点基因定位,原理同高等动、植物。 如凯泽(Kaiser, AD,1955)的试验,对三个基因进行基因定位,这三个基因是: S 突变体 产生小噬菌斑。 Co1 突变体 产生中央不透明,周围透明的噬菌斑 mi 突变体 产生微小(比S突变体更小)噬菌斑
13、 将S Co1 mi 结果见P156表7-3,在这里和前面讲的三点测验的方法相似。 双交换最少,亲本类型最多,两种单交换类型不最少也不最多,中等。 1先确定这三个基因的排列顺序。 双交换类型 S mi 亲本类型 S Co1 mi Co1 Co1在中间 SCo1 RF = 3.76% 3.76cM RF = 6.16% 6.16cM,co1,mi,s,3.76,6.16,3细菌的遗传分析 细菌DNA的重组有四种方式: 转化、接合、性导和转导。 这几种方式的重组有三个共同点: 供体DNA单方向转入受体细胞。 供体DNA在受体细胞中都形成部分二倍体。 基因只有整合到环状染色体上才能稳定遗传。,一、转
14、化(transformation) 转化:指受体细胞通过细胞膜从周围介质中直接吸收DNA片 段,并整合到本身的染色体上,使本身的基因型和表 现型发生相应变化的现象。 转染:离体状态的噬菌体核酸改变受体的遗传组成。是转化 的一种特殊形式。转染进入细胞的是完整的核酸,一 般不整合到受体的染色体上。 转化因子(transforming principle):起转化作用的DNA 片段,提供DNA分子或片段的为供体,接受DNA分 子或片段的为受体。,转化实验首先是由格瑞费斯(Griffith, F,1928)在肺炎双环球菌中发现的,后来阿委瑞(Avery, OT, 1944)等又从分子水平上得到证实,转
15、化因子是DNA,这就证明了遗传物质是DNA,而且表明转化是细菌基因重组的一种形式(参考第三章)。 转化试验主要用3种细菌研究: 1、肺炎双环球菌 2、枯草杆菌 3、流感嗜血杆菌。 。,不同类型的细菌在培养基中共培养可以形成重组型细菌, 如两个具有不同抗性的细菌群体混合培养 ,可以发现带有双抗性的细菌。这主要是由于细菌裂解后,DNA留在培养基中,其它细胞可以摄取这些DNA片断,使其本身的基因型发生了变化。这种转化的发生,大约有1%的受体细胞可以吸收外源DNA。 枯草杆菌可以将DNA直接分泌到活细胞表面,更有利于转化的发生,细菌细胞的转化 (一)供体DNA与受体细胞间的接触与互作 转化的第一步是供
16、体DNA与受体细胞接触,并发生互作。受体细菌细胞并非任何区域都允许外源DNA片段通过,而只是在特定区域形成临时性通道,这种特定区域称为受体位点,当供体DNA与受体细胞发生互作时,结合的部位就是受体位点 。在受体细胞表面这种位点存在的数目是有限的,当DNA分子浓度提高时,由于受到受体细胞受体位点的限制,转化率也不会再提高,另外受体细胞还要处于感受状态,才允许外源DNA进入受体。,转化率受转化片段的大小、形态、供体DNA分子多少的影响,如肺炎双环球菌的供体DNA分子要有800bp以上,枯草杆菌最少要有16000bp,否则,达不到转化作用。 在供体DNA片段的数量较少时,转化率会随着DNA分子的增加
17、而提高,表现为正相关关系,如果足够多时,受到受体位点数目的影响,也不会再提高。,二、供体DNA的摄取与整合 DNA分子的摄取与整合过程有以下几个点: 1结合与穿入(binding and penetration):当细菌细胞处于感受态时,具有一定长度的双链的DNA分子可以结合在受体位点,如流感嗜血杆菌平均有两个DNA分子结合,这种结合,刚开始时是可逆的,有时被核酸酶降解,有时会被冲洗下来,但这阶段时间很短,一般只有45秒。一旦结合位点达到饱和状态,即阻止其它DNA分子的结合。 结合在受体位点的DNA分子,经过很短时间即达到稳定状态,随后被细胞纵向摄取,这个过程是不可逆的,并不受培养基中的DNA
18、酶破坏,供体DNA在受体位点被受体DNA外切酶或DNA移位酶将双链DNA分子中的一条链降解,并利用降解产生的能量将另一条链拉入受体细胞。,2联会(synapsis):供体的单链DNA 片段进入受体细胞以后,寻找和其具有同 源性的染色体部位形成阶段二倍体,这种 同源性取决于供体细胞与受体细胞的亲缘 关系,亲缘关系越近越容易找到同源部 位。 3整合(integration):阶段二倍体可以 通过交换,置换下原受体细胞的DNA片 段,将供体的单链DNA整合到受体细胞的 DNA分子中。这个阶段二倍体的交换要 发生两次以上的偶次,交换一次只能打开 一个缺口,使其成为链状,发生两次以上 的偶次,就稳定的插
19、入到了受体的DNA分 子上。,(三)转化与基因重组作图 外源DNA进入受体细胞以后,形成阶段二倍体,阶段二倍体也可以发生基因重组,利用重组率可以进行基因作图。 如Lederberg等人用枯草杆菌作了如下实验: 以 trp2+ his2 ty 为供体基因型 以 trp2his2tyr 为受体基因型,注意:在计算RF值时: trp2his2:不考虑685, trp2 his2 , trp2hiy1:不考虑418, trp2 hiy1 his2try1:不考虑2600 his2 try1 是因为相应的基因可能没有进入受体细胞,所以无所谓重组和非重组。,由上表可以看出,这三个基因在一起的最多,说明这三
20、个基因是紧密连锁的,his2、tyr1连锁更紧密,因为它们并发转化的最多,根据RF值,进行染色体作图。,二、接合(Conjugation) 接合:是指两个不同交配型的细胞,通过直接接 触,将遗传信息从供体细胞转移到受体 细胞的过程。 (一)E. Coli接合的发现 1946年,莱德伯格和塔特姆发现了在E. Coli之间转移遗传物质的另一种途径接合。,他们的实验是:选择两种不同营养缺陷型的E. Coli K12菌株。 A菌株:metbiothrleu为甲硫氨基、生物素缺陷型 B菌株:metbiothrleu为苏氨酸、亮氨酸缺陷型 这两种类型都是两种物质缺陷,在 基本培养基中培养都不能生长,除 非
21、这两个基因都发生回复突变,每 个基因的突变率都是106,两个同 时发生回复突变几乎是不可能的, 在完全培养基上都可以生长。 。,把两种不同营养缺陷型的E. Coli以同等的数量同时接种在基本培养基上,发现长出了一些原养型菌落, 基因型为(metbiothrleu)。这种原养型的出现是什么原因,有两个疑问: 1重组是否为转化发生,因为在亲本细胞的处理过程中,可能发生细胞破裂、释放出转化因子和另一个亲本重组产生原养型; 2培养基中是否含有某些代谢产物,两个亲本的代谢产物互补使其可以在基本培养基上生长。,针对这两个问题,莱德伯格和塔特姆进一步作实验,将一个亲本的培养基经过细菌漏斗过滤,除去细胞,营养
22、物质和DNA片段可以通过,然后将其加入另一亲本的培养基中,结果并未产生原养型。这就排除了以上两个疑问。因而设想A、B菌株重组的必要条件是两种细胞的直接接触。,1950年戴维斯(Davis, B)设计了一个U型管实验进一步验证了以上的设想。 U型管的底部有一滤片,上有微孔,可以通过0.1m以下的颗粒,细菌的细胞无法通过,将A、B两个品系置于两个臂中,两个臂轮流吸和压促进交流和混合,DNA片段、营养物质也可以通过,两种细胞无法接触, 然后再将两个臂中的AB菌株分别接 种在基本培养基中,结果没有菌落生 成,即没有发生重组这就更有力的排 除了转化的可能,证明细菌的 直接接触是重组的必要条件。,(二)E
23、. Coli遗传物质的单方向转移与F因子的发现 1952年,海斯(Hayes, W)在重复莱德伯格和塔特姆的实验时,首先分别用高剂量的链霉素来处理A和B菌株,结果A菌株受处理后,重组不影响,而B菌株受处理后却完全阻止了重组的发生,这意味着两种菌株在杂交过程中的作用不同,不是相互交流,而是单方向转移。,因为链霉素处理A菌株时,可以阻止细菌的细胞分裂,但并不立即杀死细菌,还可以使交配持续一定的时间,交配后A菌株被杀死,并不影响重组;处理B菌株时,虽然交配也能进行,但交配后B菌株被杀死,所以后代不能形成,重组也不能发生,因而认为这个重组,遗传物质不是相互交流,而是单方向转移,即A菌株的遗传物质转向B
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