酶工程实验生物工程09.ppt
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1、本实验共有六个分实验 : 实验一 酵母蔗糖酶的纯化与纯度测定 实验二 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定纯度 实验三 酵母蔗糖酶的结晶(选做) 实验四 蔗糖酶酶学性质的研究 实验五 酵母蔗糖酶的固定化 实验六 酵母蔗糖酶活性功能基团的化学修饰,酵母中含有丰富的蔗糖酶(EC.3.2.1.26),细胞膜内侧细胞质,含有少量的糖。,外蔗糖酶,内蔗糖酶,细胞膜的外侧,占蔗糖酶活力的大部分,是含有50% 糖成分的糖蛋白。,由于内酶含量很少,极难提取,本实验提取纯化的主要是外酶。,实验一 酵母蔗糖酶的提取与纯化,本实验以酵母为原料,通过破碎细胞、加热除杂蛋白、乙醇沉淀、离子交换柱层析等步骤,分离纯化酵母蔗糖酶
2、,并用聚丙稀酰胺凝胶电泳对其纯度进行初步检验。,有机溶剂分级的原理:有机溶剂分级是利用不同蛋白质在不同浓度的有机溶剂中溶解度的差异分离酶蛋白的一种方法。 其原理是: 1、有机溶剂能降低溶液的介电常数,增加蛋白质分子上不同电荷的引力,使蛋白质溶解度下降; 2、有机溶剂与水作用,能破坏蛋白质的水化膜,使蛋白质的溶解度下降。,结合力的大小取决于彼此之间相反电荷基团的静电引力,静电引力大小与溶液的pH值有关,因pH值决定蛋白质的解离程度。,阳离子交换剂 样品溶液pHpI时,酶带正电荷; 阴离子交换剂 样品溶液pHpI时,酶带负电荷 一般样品溶液的pH与酶pI相差一个pH以上,样品溶液的pH与酶pI相差
3、越大的,带电荷越多,通过逐渐增加洗脱液离子强度的梯度洗脱方式,可使结合在层析柱上的蛋白质按照结合力由小到大的顺序依次被洗出层析柱。,Sample application and wash,Elution,Equilibration,Regeneration,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,-,本实验中使用的DEAE-52是弱碱性的阴离子纤维素,其基本骨架是纤维素、活性基团为二乙基氨乙基(DEAE)。该纤维素的吸附量大,分辨率高,化学性质稳定。,控制:样品溶液pHpI时,酶带负电荷,离子交换柱层析的原理: 根据物质的酸碱度、极性和分子大小的差异,使其分离的技术在分离过程中,以
4、离子交换剂作用为主导。在众多的交换剂中,离子交换纤维素的优点是: 1、开放性的长链结构、较大的表面积,所以对蛋白质吸附容量大; 2、纤维素上离子基团数量不多且排列疏散,对蛋白质的吸附不是太牢固,所以用缓和的洗脱条件即可达到分离目的,不致引起蛋白质变 3、用其装好的层析柱在较广的pH和盐浓度范围内都不会发生体积的改变,所以有利于蛋白质层析。 本实验中使用的DEAE-52是弱碱性的阴离子纤维素,其基本骨架是纤维素、活性基团为二乙基氨乙基(DEAE)。该纤维素的吸附量 大,分辨率高,化学性质稳定。,为了确定哪个峰是含目标酶,要进行酶活力的测定; 用蔗糖做底物反应一段时间后,检测生成的葡萄糖的量;用尿
5、糖试纸初步检测;用DNS法精确检测。,Sucrase(蔗糖酶),glucosefructose,Sucrose,Semi-quantitative assay of yeast sucrase activity with U-Glu test-tape Sucrose glucose oxidase(葡萄糖氧化酶 ) gluconic acidH2O2 (葡萄糖酸 ) H2O+O2- coloured substance,Sucrase(蔗糖酶),glucosefructose,Hydrogen peroxidase(过氧化氢酶),colourless substance(无色物质),U-Gl
6、u test-tape 尿糖试纸,DNS法精确检测,黄色的3,5-二硝基水杨酸(DNS)试剂与还原糖在碱性条件下共热后,自身被还原为棕红色的3-氨基-5-硝基水杨酸。在一定范围内,反应液里棕红色的深浅与还原糖的含量成正比而葡萄糖生成量又与待测液的酶活力大小成正比。,酶活定义: 在37 ,Ph4.5,每分钟催化蔗糖生成1M葡萄糖的酶量为1个酶活力单位。,DNS法测葡萄糖浓度,附图:葡萄糖标准曲线,为了确定获得的目标酶纯不纯,要进行SDS-PAGE电泳检测;,二、实验步骤,1.破碎细胞 取5 g干酵母,加5 g石英砂,置于预先冷却的研钵中,加30 mL去离子水,研磨30 min,在冰箱中冰冻约10
7、 min(研磨液面上刚出现冰结为宜),重复2次。将研磨液转移至大离心管中,12000 r/min离心15 min,弃去沉淀。留0.5 mL上清液为第一组分。,2.加热除杂蛋白 将上清液转入三角瓶,用1 mol/L醋酸溶液逐滴加入,调其pH值至5.0,然后迅速放入50的水浴中,保温30 min。在温育过程中,注意经常缓慢搅拌液体。之后在冰浴中迅速冷却之,以12000 r/min的转速离心20 min,弃去沉淀。留0.5 mL上清液为第二组分。,3.乙醇沉淀 量出上清液的体积,加入等体积的95%冷乙醇溶液(预先放在-20低温下的时间不少于30 min),于冰浴中温和搅拌20 min。然后以1200
8、0 r/min的转速离心25 min,小心弃去上清液,沉淀沥干。将沉淀溶解在6 mL 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)中,搅拌(5 min以上)使其完全溶解,以12000 r/min的转速离心25 min,取出0.5 mL上清液作为第三组分,剩余部分(乙醇抽提液)进行第4步操作。,4.上柱 装DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换柱层析,用0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)平衡。将乙醇抽提液上柱,上样后用0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)平衡,然后用0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(内
9、含0.5 mol/L NaCl溶液,pH值7.3)进行NaCl梯度(NaCl溶液浓度为0-0.5 mol/L)洗脱。,层析柱连上梯度混合器,混合器分别装30 mL 0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3)和30 mL含有0.5 mol/L NaCl的0.05 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH值7.3),每1 min收集1管。洗脱至混合器中液体流完为止,测定各接收管在280 nm下的光吸收值,并用尿糖试纸半定量测定各管的酶活力。收集酶活力最高的1管酶液作为第四组分用于纯度测定。,5.用尿糖试纸进行半定量测定: 在白瓷板每孔中分别滴3滴待测酶液,再加3滴含10蔗糖的pH
10、 4.5的醋酸缓冲液,搅匀,37放置10 min,浸入尿糖试纸,1 s后取出,60 s后比较颜色的深浅,与比色卡对照。,6. DNS法精确检测,试剂配制,葡萄糖标准液配制(1mg/ml):预先将分析纯葡萄糖置80烘箱内约12小时。准确称取500mg葡萄糖于烧杯中,用蒸馏水溶解后,移至500ml容量瓶中,定容,摇匀(冰箱中4保存期约一星期)。 醋酸buffer(0.2mol/L)称取3.28g无水乙酸钠,溶解于150ml蒸馏水,用冰乙酸调节其ph至4.5,然后定溶至200mL。 10%蔗糖溶液:10g蔗糖溶解于醋酸buffer(0.2mol/L)中,定容至100ml 1mol/L NaoH溶液:
11、4gNaoH溶解于100ml蒸馏水中,四、结果分析 以梯度洗脱出的管数为横坐标,以吸光度A280、酶活、NaCl浓度为纵坐标,绘出层析曲线和酶活曲线图。 五 思考题: 离子交换纤维素层析的优点有哪些? 有机溶剂抽提蛋白质的原理是什么?,数据处理,Review Total activity Specific activityhow to calculate it, what it means, how it changes during a purification Fold purificationwhat it is, how to calculate it Yieldwhat it is,
12、 how to calculate it, how it changes during a purification,两重要概念,1:回收率是纯化后的总活力除以纯化前的总活力 2: 纯化倍数是纯化后的比活力除以纯化前的比活力(第一次的比活力) 注:比活力:比活力活力单位数mg蛋白,实验二 SDS-PAGE电泳,一、实验步骤 1. 试剂配制,(1)丙烯酰胺和N, N-亚甲双丙烯酰胺。以温热(利于溶解双丙烯酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙烯酰胺和1%(w/v)N, N-亚甲双丙烯酰胺的贮存液 。,(2)1.5M Tris,pH8.8(分离胶缓冲液):1.5M Tris-HCl,0.4%
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